药用植物DNA标记辅助育种（一）：三七抗病品种选育研究

董林林+陈中坚+王勇+魏富刚++张连娟+徐江++尉广飞+王瑞+杨娟+刘伟林++李西文+余育启+陈士林

[摘要]药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型关联的DNA片段作为标记，辅助新品种的选育。该研究采用DNA标记辅助育种结合系统选育的技术，选育首个三七抗病新品种“苗乡抗七1号”。结果表明，基于RADSeq技术检测出抗病品种包含12个特异SNP位点，经验证record_519688位点与三七抗根腐病相关，包含此位点的基因片段可作为抗病品种的遗传标记辅助三七系统选育；与常规栽培种相比，抗病品种种苗根腐病及锈腐病的发病率分别下降836%，718%；二年生及三年生三七根腐病的发病率分别下降436%，629%。此外，依据与抗病关联的SNP筛选三七潜在的抗病群体，该模式扩大目标群体并提高选育效率。药用植物DNA标记辅助育种将加快药用植物新品种选育及推广的进程，保障中药材产业健康发展。

[关键词]药用植物； DNA标记辅助育种； 三七； 连作障碍； 抗病品种；简化基因组测序技术； 单核苷酸多态性

药用植物传统育种主要依赖于植物的表型选择，一个优良品种的培育往往需要花费几年甚至十几年的时间，如何提高育种效率，是育种的关键。基因型与环境间互作等多重因素会影响表型选择效率，现代分子生物技术可加快药用植物育种进程，而且缩短育种周期，其中药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型相联的DNA片段作为标记，辅助新品种的选育，该技术可应用于遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源遗传多样性、分子标记辅助选择等方面。随着测序成本的降低，已经陆续在中草药开展了转录组、全基因组测序，这些序列信息提供了大量的SSR和SNP等分子标记，有利于高密度遗传图谱和物理图谱的构建，高密度图谱加速了分子标记与优良性状之间的连锁研究，为发掘植物抗逆及参与有效成分合成途径的新基因提供了许多线索和启示，提高了选育的效率。陈士林等首次提出“Herbgenomics”的概念，该学科涉及中草药结构基因组、功能基因组、基因组辅助育种、中草药蛋白质组学、中草药宏基因等内容，并阐明本草基因组学将加速药用植物优良品种的选育并促进绿色中药农业的科学化和规模化发展[12]。

本文以三七Panax notoginseng（Burk）FH Chen为例，介绍了药用植物依据DNA多态性为基础，利用高通量测序技术筛选与抗病相关联的SNP标记，辅助三七抗病新品种的选育。三七是五加科人参属植物，其性温、味甘、微苦，具有散瘀止血、消肿定痛的功能，是片仔癀、云南白药、复方三七口服液等常见中药制剂的主要原料之一[3]。三七在心脑血管方面的独特疗效越来越被人们所认可，其需求量逐年增加。为满足日益增长的需求，三七已经开展了系统的栽培技术研究，形成了较为规范的GAP技术体系[4]。然而三七为典型的生态脆弱型阴生植物，其分布区域较窄，连作障碍等问题严重[56]。三七的人工栽培过程中病虫害比较严重，例如根结线虫病害显著抑制了三七块根的生长，抑制率高达30%以上[7]；三七种植导致根际土壤微生物多样性及组成的变化，随着其种植年限增加根腐病致病菌Fusarum oxysporum的丰度显著增加[8]。在病害防治过程中，高毒农药的投入破坏了三七田间生态系统，并造成三七农残及重金属超标。而三七不同栽培品种的抗病性存在显著性差异，选育抗病性品种可获得性状优良、抗逆性强的三七群体植株，有效的减少农药的使用量[911]。抗病新品种的选育是保障三七产业可持续发展的策略之一。

系统选育是三七遗传改良的方式之一，也是三七育种的重要手段。孫玉琴等对三七植株性状差异进行比较，结果表明三七植株的茎、块根、休眠芽、花序、叶、果实存在明显变异，为三七育种工作提供了依据[12]。通过对三七不同变异类型中皂苷含量的比较分析，确定将紫根、复叶柄平展型、长形根、宽叶4种类型作为三七品种选育的目标[13]。然而系统选育育种周期长，受环境影响较大，在短时间内选择优良性状难度极大。采用DNA标记辅助三七新品种的选育，该方法不仅准确性高，而且缩短育种周期。本研究利用高通量测序技术检测抗病群体中的SNP位点，结合PCR技术筛选与三七抗病关联的DNA片段，以此基因片段作为标记辅助系统选育，并利用该关联基因片段筛选潜在的抗病群体。该模式可加快新品种选育及推广的进程，为中药材可持续发展提供思路及策略。

1材料与方法

11三七DNA标记辅助新品种选育流程从文山周边收集抗病单株并播种于云南文山三七科技示范园的试验田，该试验田为三七连作5年病圃。采集病圃中存活三七单株的种子，建立抗病群体；采用简化基因组测序技术（restrictionsite associated dna sequencing，RADSeq） 结合PCR技术筛选抗病群体的关联SNP位点，辅助三七新品种的系统选育；通过淘汰非目标性状，分离和纯化抗病群体，选育三七抗病新品种，三七DNA标记辅助选育流程见图1。

12SNP位点分析采用高通量测序技术筛选抗病植株特异的SNP位点，阐述其特异性。分别采集30株抗病及感根腐病三七植株，采用HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找SNP标记。测序流程为：利用多种限制性内切酶对该物种DNA分别进行酶切，根据酶切实验的结果选择合适的酶进行后续实验；质检合格的DNA样品，采用RAD建库方式构建长度范围在300～500 bp的pairend文库；Illumina HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找海量SNP标记。

首先，对每个样品中的RADtag进行比对归类，按照每类tag的深度信息由大到小进行排序，得到每个个体的RADtag频数表[14]。每个样品的RADtag内部进行比对得到样品内部的杂合位点信息。不同样品之间的RADtag进行互相的比对，寻找个体之间单碱基差异信息[15]。综合考虑每个个体RADtag的频数表信息和比对信息，过滤掉可能来自重复区域的结果，从而得到高可信度的群体SNP标记基因分型结果[16]。其中性状关联的算法参照GLM（General Linear Model）模型[17]。

13SNP位点开发基于RADSeq技术获得的SNP位点，设计引物筛选与三七抗病性关联的SNP位点。在人工病圃中分别采集60株三七抗病株及感根腐病植株，采用植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取三七叶片总DNA，DNA浓度及质量经检验后，于-20 ℃备用。随机挑选SNP位点进行开发，以record_519688位点设计抗病及对照群体的通用引物，引物序列为F1：5′TCATTATTATTATCCTC3′，R1：5′GAGCTTAACTAGCCCAG3′。针对上述SNP位点设计抗病群体的特异引物，为提高SNP分析的特异性，在特异引物的3′端区域加入1个人工错配碱基，序列信息为Fk1：5′CATTATTATTATCCTCTTC3′，其中反向引物为R1。采用Pyrobest DNA Polymerase（货号 DR005A，日本TaKaRa公司）对供试DNA进行PCR扩增，反应体系参照王瑞等[18]报道。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，产物送美吉公司进行测序。将产物的序列信息与RADSeq获得的序列进行比对，确定与抗病相关联的SNP位点。

14种苗等级分析将抗病群体的种子收集并播种后，分析种苗等级（n=186），其分类等级依据见表1，同时以常规栽培品种（n=186）为对照，分析抗病品种的种苗质量。表1三七种苗分级标准

Table 1The classification standard of notoginseng seedlings

分级单株重/g外观形态一级≥25休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤二级125～25休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤三级075～125休眠芽生长一般，根系生长一般，无病虫感染和机械损伤

15病害调查随机取30株种苗，分析其病害类型及发病情况，以常规栽培种为对照，3次重复；调查二年生及三年生三七病害类型及发病率（n=60），并以常规栽培种为对照，3次重复。

16利用与抗病关联的SNP位点筛选潜在抗病群体采用与抗病性关联SNP位点（record_519688）的引物筛选留种基地的三七单株，保留含目标位点的植株栽种到人工病圃中进行系统选育，该模式扩大三七目标株系的繁育群体，提高育种效率并加快其新品种推广的进程。

17数据分析采用SPSS 160软件，在005水平进行显著性方差分析。

2结果

21抗病植株的SNP位点开发结合SNP数据和表型数据，使用tassel v52进行性状关联分析，与感病群体相比，抗病群体具有12个差异的SNP位点（极显著LOD>3）.

833%），而感病株无条带，见图2B。测序产物序列与RADSeq序列结果一致，感病株与抗病株的变异位点，见图2C。结果表明，本试验中该SNP位点与三七抗病性相关，可作为三七抗病品种的DNA标记。依据该位点对抗病群体后代进行选择，目标株为667%，淘汰非目标株辅助系统选育。

A通用引物PCR产物；B特异引物PCR产物；C感病株与抗病株的PCR产物序列信息；1～10及a～k抗病品种；11～12感病品种；MDNA Marker；CK感病株；RC抗病株。

22三七抗病品种的种苗等级基于三七种苗质量及外部形态，制定了种苗的等级指标见图3A。休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤，单株质量大于等于25 g的种苗为一级，单株质量125～25 g的种苗为二级；休眠芽及根系生长一般，无病虫感染和机械损伤，单株质量075～125 g的种苗为三级；单株质量小于075 g為级下种苗。常规栽培种与抗病品种的一级种苗分别为400%，389%；二级种苗分别为156%，267%，三级种苗分别为111%，167%，级下种苗分别为333%，178%见图3B。常规栽培种及抗病品种的一级和二级种苗总量分别为556%，656%。

23三七抗病品种的病害类型及发病率调查发现，该试验区内常规栽培种及抗病品种种苗的主要病害类型为根腐病及锈腐病，见图4。常规栽培种及抗病品种种苗根腐病的发病率分别为67%，11%，而锈腐病发病率分别为156%，44%，抗病品种的根腐病及锈腐病发病率分别下降836%，718%。结果表明，抗病品种种苗对根腐病及锈腐病表现显著的抗性。

调查结果表明，二年及三年生三七主要病害类型为根腐病，见图5A，B。常规栽培种及抗病品种的

二年生三七根腐病发病率分别为34%，19%，三年生三七该病的发病率为114%，42%，见图5C。与对照相比，二年及三年生三七抗病品种的根腐病发病率显著下降了436%，629%。结果表明，二年及三年生三七抗病品种对根腐病表现出显著的抗病性。

24利用与抗病关联的SNP位点筛选潜在抗病群体在3个留种基地进行5 000份单株留种，利用抗病品种的SNP位点进行筛选，见图6。留种基地分别为平远镇莲花塘、砚山县郊址村及文山县平坝镇。随机抽取每个基地100份单株，采用通用引物（F1，R1）均检测出清晰的目标条带（n=300），特异引物（Fk1，R1）检测该300份三七样品的56份样品包含清晰的目标条带。结果表明，随机检测的自然群体中，包含目标位点的单株为187%。后续试验中将目标株通过人工病圃进行系统选育，加快抗病品种的扩繁。

4讨论

本研究利用DNA标记辅助系统选育技术获得首个三七抗病新品种，选育纯化后的抗病品种表现一致性、稳定性及特异性，作为新品种进行登记，该品种命名为“苗乡抗七1号” （云林园植新登第2016060号），对根腐病具有显著的抗性。本研究采用简化基因组测序技术，快速检测抗病品种的SNP位点，依据抗病表型结合PCR技术筛选并确定与抗病相关的SNP位点，利用该位点筛选目标株辅助系统选育，加快三七抗病新品种的选育。此外，利用该关联位点辅助筛选留种基地潜在的抗病群体，之后将包含目标位点的株系在人工病圃中进行系统选育，进一步筛选并纯化抗病群体，该模式扩大了目标株系的繁育群体，提高育种效率并加快中药材的选育及推广，研究结果将陆续发表。

利用DNA序列的遗传多态性可建立物种的遗传标记，加快药用植物品种选育的进程。检测DNA

水平上的遗传变异最精确的方法是直接测定DNA序列，因此可利用高通量测序技术对测定的物种进行分析比较，揭示生物体在单个核苷酸水平上的遗传多态性，辅助系统选育。RADSeq技术是在二代测序基础上发展起来的一项基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术，技术流程简单，不受有无基因组的限制，即可获得数以万计的多态性标记，该方法快速鉴定高标准性的变异标记（SNP），已广泛应用于分子育种，系统进化，种质资源鉴定等领域[19]。石璇等[20]以简化基因组测序技术获得40 765个有效单核苷酸多态（SNP），并用这些SNP位点分析了8个种质的群体结构和系统发生树。简化基因组测序能高效、低成本开发出大量可用于群体遗传分析的SNP标记，为新品种的选育奠定基础。本研究利用简化基因组技术检测SNP位点，为三七分子辅助育种提供有效的分子标记，并为无参考基因组中药材分子辅助育种提供思路及策略。此外，前期工作中作者解析了三七块茎的转录组，获得30 852 单一序列，其中702% 的序列为注释序列，筛选出11个参与三萜皂苷生物合成途径的基因[21]；并依据转录组数据克隆了三萜皂苷合成途径中编码关键酶的基因（PnSE1，PnSE2）[2223]。因此可依据三七转录组及表达谱的研究，以参与或调控皂苷合成途径的关键基因为目标基因，辅助选育高产优质的三七新品种，进而保障优质无公害的三七原料。

本研究首次对三七抗病品种进行系统选育，利用连作5年地块作为三七抗病品种筛选的病圃，选种明确并加快了选育的进程。随着栽培面积的不断扩大，连作障碍造成三七的损失巨大，已成为制约该地区三七产业可持续发展的重要因素[2425]。三七栽培中根腐病及锈腐病是其主要病害类型，其中根腐病造成损失可达70%以上，甚至可导致毁园绝收[2627]。因此，抗根腐病三七新品种的选育是克服连作障碍的有效途径之一。三七的单株根重、株高、茎粗等主要农艺性状与种苗质量有明显的相关性，表现出随着种苗质量等次的提高而增加的趋势；且三七产量也随着种苗等级的提高而提高[28]。本研究中抗病品种的一级及二级种苗总量高于常规栽培品种，抗病品种的种苗对根腐病及锈腐病表现较强的抗性，两年生及三年生三七对根腐病表现显著的抗性，该三七抗病新品种的大面积推广将有效减少农药的使用量，减轻环境污染，降低农残对人体健康的危害，促进并保障三七产业的可持续发展。本文以三七为例系统阐述了药用植物DNA标记辅助育种，而抗病关联DNA标记的进一步验证及潜在抗病群体筛选的研究将在后续文章中发表。

[参考文献]

[1]Chen S， Song J， Sun C， et al. Herbal genomics：examining the biology of traditional medicines[J]. Science， 2015， 347（6219S）：S27

[2]陈士林， 宋经元. 本草基因组学[J]. 中国中药杂志， 2016，41（21）：3381

[3]夏鹏国，张顺仓，梁宗锁，等. 三七化学成分的研究历程和概况[J]. 中草药，2014，45（17）：2564

[4]陈中坚，孙玉琴，黄天卫，等. 三七栽培及其GAP研究进展[J]. 世界科学技术——中医药现代化，2005，7（1）：67

[5]丁艳芬，邓德山，苏梅，等. 依托科技创新发展三七产业[J]. 世界科学技术——中医药现代化，2012，14（6）：2255

[6]张重义，林文雄. 药用植物的化感自毒作用与连作障碍[J]. 中国生态农业学报， 2009（17）：189

[7]Dong L， Yao H， Li Q， et al. Investigation and integrated molecular diagnosis of rootknot nematodes in Panax notoginseng root in the field[J]. Eur J Plant Pathol， 2013， 137（1）：667

[8]Dong L， Xu J， Fen G， et al. Soil bacterial and fungal community dynamics in relation to Panax notoginseng death rate in a continuous cropping system[J]. Sci Rep， 2016， 6：31802

[9]陳中坚，王勇，曾江，等. 三七植株的性状差异及其对三七产量和质量影响的调查研究[J]中草药，2001，32（4）：71

[10]罗文富，贺承福. 三七根腐病病原及复合侵染的研究[J]. 植物病理学报，1997， 27（1）：85

[11]孙玉琴，陈中坚，李一果，等. 三七的植株性状差异观察[J]. 现代中药研究与实践，2003，17（增）：16

[12]孙玉琴，陈中坚，黄天卫，等. 三七不同变异类型中皂苷的差异研究[J]. 中草药，2010，41（6）：993

[13]Baird N A， Etter P D， Atwood T S， et al. Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers[J]. PLoS ONE， 2008， 3（10）：e3376

[14]Catchen J M， Amores A， Hohenlohe P， et al. Stacks：building and genotyping loci de novo from shortread sequences[J]. G3 Genesgenetics， 2011， 1（3）：171

[15]Hohenlohe P A， Bassham S， Etter P D， et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags[J]. PLoS Genet， 2010，6（2）：e1000862

[16]Bradbury P J， Zhang Z， Kroon D E， et al. TASSEL：software for association mapping of complex traits in diverse samples[J]. Bioinformatics， 2007， 23（19）：2633

[17]王瑞，董林林，徐江，等. 农田栽参模式中人参根腐病病原菌鉴定与防治[J]. 中国中药杂志，2016，41（10）：1787

[18]王洋坤，胡艳，张天真. RADSeq技术在基因组研究中的现状及展望[J]. 遗传，2014， 36（1）：41

[19]石璇，王茹媛，唐君，等. 利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性[J]. 作物学报，2016，42（5）：641

[20]Luo H， Sun C， Sun Y， et al. Analysis of the transcriptome of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponinbiosynthetic genes and genetic markers[J]. BMC Genomics， 2011， 12：S5

[21]Niu Y， Luo， H， Sun C， et al. Expression profiling of the triterpene saponin biosynthesis genes FPS， SS， SE， and DS in the medicinal plant Panax notoginseng[J]. Gene， 2013， 533（1）：295

[22]牛云云，朱孝轩，罗红梅，等. 三萜皂苷合成生物学元件的初步开发：三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析[J]药学学报，2013（2）：211

[23]马承铸，顾真荣，李世东，等. 两种有机硫熏蒸剂处理连作土壤对三七根腐病复合症的防治效果[J]. 上海农业学报，2006，22（1）：1

[24]孫玉琴，韦美丽，陈中坚，等. 化感物质对三七种子发芽影响的初步研究[J]. 特产研产，2008，30（3）：44

[25]王勇，陈昱君，范昌，等. 三七锈腐病的发生规律调查研究[J]. 现代中药研究与实践，2003（S1）：27

[26]刘莉，刘大全，金航，等. 三七连作障碍的研究进展[J]. 山地农业生物学报，2011，30（1）：70

[27]陈中坚，杨莉，王勇，等三七栽培研究进展[J]. 文山学院学报，2012，25（6）：1

[28]崔秀明，王朝梁，陈中坚. 种苗分级对三七生长和产量的影响[J]. 中药材，1998（2）：60[责任编辑吕冬梅]

2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1Januar