基于谱效关系的小儿肺热咳喘颗粒抑菌作用研究

王执一 曾珊 罗勇 谢晓 徐杨 伍利华

摘要：目的 建立小儿肺热咳喘颗粒高效液相色谱（HPLC）特征图谱，研究小儿肺热咳喘颗粒对肺炎链球菌的抑菌活性并建立谱效关系模型。方法 以HPLC法测定15批小儿肺热咳喘颗粒特征图谱；牛津杯法研究抑菌活性。采用《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）建立15小儿肺热咳喘颗粒特征图谱并进行相似度评价和特征峰指认。以相对抑菌活性为抑菌作用指标，进行灰色关联度分析，利用SPSS 21.0软件进行Pearson相关性分析，建立谱效关系模型并验证。结果 共得到13个特征峰，相似度不低于0.936；指认2、9、11号峰为绿原酸、黄芩苷、木犀草素，13个特征峰均与相对抑菌活性呈正相关，灰色关联度值为0.743～0.924，2、9、11、12号峰为抑菌主要活性成分；验证3批小儿肺热咳喘颗粒样品相对抑菌活性的预测值与测量值相对误差均小于6%。结论 小儿肺热咳喘颗粒抑制肺炎链球菌主要成分包括绿原酸、黄芩苷、木犀草素，且抑菌作用可能由多种成分协同作用产生，与多味药材的配伍有关，验证了中成药具有多成分协同作用的特点；初步确定建立的谱效关系模型可用于小儿肺热咳喘颗粒抗菌作用的预测与评价。

关键词：小儿肺热咳喘颗粒；特征图谱；肺炎链球菌；抑菌活性；谱效关系

中图分类号：R285文献标志码：A

Study on the antibacterial effect of Xiao'er Feire Kechuan Granules based on spectrum-effect relationship

Wang Zhiyi1，  Zeng Shan1，  Luo Yong2，   Xie Xiao1，  Xu Yang1，  and  Wu Lihua3

（1 School of  pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106；2 Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co.，  Ltd.， Lianyungang 222001；

3 School of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To establish the high performance liquid chromatography（HPLC） characteristic chromatogram of Xiao'er Feire Kechuan Granules， study the antibacterial activity of Xiao'er Feire Kechuan Granules against Streptococcus pneumoniae and establish the spectrum-effect relationship model. Methods The characteristic chromatograms of 15 batches of Xiao'er Feire Kechuan Granules were determined by HPLC. The antibacterial activity was studied by the Oxford Cup method. The similarity evaluation system of traditional Chinese medicine fingerprints （2012 A edition） was used to establish the characteristic spectrum of 15 Xiao'er Feire Kechuan Granules， and the similarity evaluation and characteristic peak identification were carried out. The relative bacteriostatic activity was used as the bacteriostatic index，  and the gray correlation analysis was carried out. The Pearson correlation analysis was carried out by SPSS 21.0 software，  and the spectrum-effect relationship model was established and verified. Results A total of 13 characteristic peaks were obtained，  and the similarity was not less than 0.936. Peaks 2，  9 and 11 were identified as chlorogenic acid，  baicalin and luteolin，  respectively. These 13 characteristic peaks were positively correlated with the relative antibacterial activity，  and the gray correlation degree was 0.743～0.924. Peaks 2，  9，  11 and 12 were the main antibacterial active components. The relative error between the predicted value and the measured value of the relative antibacterial activity of 3 batches of Xiao'er Feire Kechuan Granules was less than 6 %. Conclusion The main components of Xiao'er Feire Kechuan Granules inhibiting Streptococcus pneumoniae included chlorogenic acid，  baicalin and luteolin，  and the antibacterial effect might be produced by the synergistic effect of various components，  which is related to the compatibility of multiple medicinal materials，  which verified that Chinese patent medicine had the characteristics of the multi-component synergistic effect. The established spectrum-effect relationship model could be used to predict and evaluate the antibacterial effect of Xiao'er Feire Kechuan Granules.

Key words Xiao'er Feire Kechuan Granules; Feature map; Streptococcus pneumoniae; Antibacterial activity; Spectral efficiency relationship

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起急性呼吸道感染性疾病的主要致病菌之一，主要引起肺炎，继发气管炎或脑膜炎等疾病[1]。有研究表明小儿肺热咳喘颗粒对肺炎链球菌有一定抑菌作用[2]。小儿肺热咳喘颗粒是由经典名方“麻杏石甘汤”[3]改良而成的现代中药制剂，由麻黄、苦杏仁、石膏、知母、黄芩、板蓝根、金银花、连翘、鱼腥草、麦冬和甘草等11味药组成。主要功效有清热解毒、宣肺平喘、止咳化痰等，临床常用于治疗儿童肺炎类疾病[4-5]。倪文琳等[6]通过多成分含量测定对小儿肺热咳喘颗粒进行质量评价，但并未联系药效。基于上述，本课题组将采用HPLC法建立小儿肺热咳喘颗粒特征图谱，采用牛津杯法研究小儿肺热咳喘颗粒对肺炎链球菌的抑菌作用，将特征峰与抑菌作用进行相关性分析和灰色关联度分析，建立谱效关系。

1 主要仪器与材料

1.1 仪器

LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司）、JJ-CJ-2FD型洁净工作台（苏州市金净净化设备科技有限公司）、SQP型万分之一电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、TG20G型离心机（天津广丰科技有限公司）、DH3006A型电热恒温培养箱（西安禾普生物科技有限公司）、电子数显卡尺（成都成量工具集团有限公司，量程规格 0～150 mm 精度：0.01 mm）、XFS-280型手提式压力蒸汽灭菌器（浙江新丰医疗器械有限公司）。

1.2 供试药品

小儿肺热咳喘颗粒（四川光大制药有限公司），黄芩苷对照品、绿原酸对照品、木犀草素对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号 wkq21010608、wkq20042702、wkq21040905，纯度≥98%），色谱级乙腈（西格玛奥德里奇上海贸易有限公司），分析级甲醇、磷酸（成都科隆化学品有限公司，批号 2022080102、2018110501），血琼脂培养基（常德比克曼生物科技有限公司），阿莫西林胶囊（葵花药业 批号：22063111），0.5MCF比浊管（温州市康泰生物科技有限公司，批号：UL25130），纯净水。

1.3 菌种

肺炎链球菌（BNCC北纳生物科技有限公司，批号：22031117）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Supersil AQ-C18（4.6 mm×250 mm，

5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），柱温为25 ℃；进样量为10 μL；流速为0.8 mL/min；检测波长为294 nm，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

2.2 供试品的制备

精密称定3.0 g小儿肺热咳喘颗粒于锥形瓶内，加25 mL 50%甲醇，超声（40 kHz，240 W）20 min溶解，滤过，取续滤液适量，离心（8000 r/min）20 min，取上清液，经0.45 ?m微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

称取“1.2”项下小儿肺热咳喘颗粒（批号：2101005）3.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以峰面积大且稳定、分离度较好的黄芩苷色谱峰作为S峰，取其峰面积和保留时间计算RSD。结果表明峰面积和保留时间的RSD均小于1.3%，即仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

称取“1.2”项下小儿肺热咳喘颗粒（批号：2101005）3.0g，按“2.2”项下方法制备供试品，平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积大且稳定，分离度较好的黄芩苷色谱峰作为S峰，取其单位取样量下的峰面积和保留时间计算RSD。结果，峰面积和保留时间的RSD均小于1.2%，表明本方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

称取“1.2”项下小儿肺热咳喘颗粒（批号：2101005）3.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品，分别于室温下放置0、1、2.5、4、7和15 h后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积大且稳定，分离度较好的黄芩苷色谱峰作为S峰，取其峰面积和保留时间计算RSD。结果，峰面积和保留时间的RSD均小于1.2%，表明供试品溶液在室温下放置15 h稳定性良好。

2.4 小儿肺热咳喘颗粒HPLC特征图谱研究

2.4.1 小儿肺热咳喘颗粒HPLC特征图谱生成

取15批小儿肺热咳喘颗粒分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。将15批小儿肺热咳喘颗粒样品的特征图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行分析，得到小儿肺热咳喘颗粒样品HPLC叠加指纹谱图和对照特征图谱，详见图1～2。

2.4.2 相似度评价

选取每批小儿肺热咳喘颗粒特征图谱中峰形较好的13个色谱峰，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）评价相似度，并绘制动态热图。结果表明15批小儿肺热咳喘颗粒样品的相似度均不低于 0.936，详见表2。

2.4.3 特征峰指认

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，设置时间窗口为0.1 min，选择15批小儿肺热咳喘颗粒HPLC特征图谱中峰形较好的色谱峰进行多点校正，以中位数法生成HPLC对照图谱，指认出13个特征峰；向“2.2”项下方法制备的供试品中加入少量对照品，指认出2号峰为绿原酸、9号峰为黄芩苷、11号峰为木犀草素。以9号峰峰面积为参照，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果详见表3～4。

3 小儿肺热咳喘颗粒抑菌作用研究

3.1 细菌培养

用接种环蘸取少量BNCC北纳生物科技生产的肺炎链球菌，溶于少量无菌水中，摇匀。用接种环蘸取少量菌液，采用平板划线法接种于血琼脂培养基中，37 ℃恒温培养24 h，出现明显菌落后，挑取少量细菌溶于无菌水中，采用上述同样方法进行传代，即得。

3.2 药液浓度筛选

采用牛津杯法[7]，用接种环挑取适量“3.1”项下传代得到的肺炎链球菌，以无菌水调制1.5×

108 CFU/mL菌液，倒平板于血琼脂培养基中，分别配置0.02、0.04、0.06、0.12和0.24 g/mL 浓度的小儿肺热咳喘颗粒溶液，分别吸取各浓度溶液80 μL注入牛津杯中，37 ℃恒温培养24 h，观察菌圈辨识度，结果表明药液浓度为0.06 g/mL时抑菌效果最佳。

3.3 菌液浓度筛选

采用牛津杯法，用接种环挑取“3.1”项下传代得到的肺炎链球菌，加入适量无菌水，用比浊管比对制成3.75×107、7.5×107、1.5×108 、3×108 和6×

108 CFU/mL的菌液，分别倒平板于5个血琼脂培养基中，每个平板放入1个牛津杯，取配置好的供试品溶液（0.06 mg/mL），分别吸取80 μL注入牛津杯中，

37 ℃恒温培养24 h，观察菌圈辨识度，结果表明菌液浓度为1.5×108  CFU/mL时抑菌效果最佳。

3.4 供试品、阳性对照的制备

称取3.0 g小儿肺热咳喘颗粒，精密称定，精密量取50 mL水溶解制成0.06 g/mL溶液，即得；对照品为6.16 μg/mL浓度的阿莫西林溶液。

3.5 方法学考察

精密度试验按“3.4”项下方法制备供试品，采用牛津杯法分别吸取80 μL供试品于同一培养基6个牛津杯中，结果显示菌圈大小RSD为0.7%，表明该方法精密度良好。

重复性试验按“3.4”项下方法平行制备6份供试品，采用牛津杯法吸取每份供试品80 μL于同一培养基6个牛津杯中，结果显示单位取样量抑菌圈大小RSD为0.37%，表明该方法重复性良好。

稳定性试验按“3.4”项下方法制备供试品，采用牛津杯法在6个血琼脂培养基上隔0、 0.5、1、2、4和6 h进行加样操作，结果显示抑菌圈大小RSD为0.7%，表明该方法在6 h内稳定性良好。

线性关系试验分别吸取80 μL浓度分别为1.54、2.31、3.08、4.62和6.16 μg/mL的阿莫西林溶液于同一血琼脂培养基5个牛津杯中，以浓度为自变量，菌圈面积为因变量进行线性回归，结果显示r2=0.999，回归方程Y=51.1218X＋192.007。

3.6 相对抑菌活性研究

按“3.4”项下方法制备供试品，用接种环挑取“3.1”项下传代得到的肺炎链球菌，以无菌水调制1.5×108 CFU/mL菌液，倒平板于血琼脂培养基中，采用牛津杯法，分别吸取供试品溶液、对照品溶液、水各80 μL点样于同一血琼脂培养基中，37 ℃恒温培养24 h，测定抑菌圈横竖直径，计算菌圈面积和相对抑菌活性，结果见表5，抑菌图见图3。

4 小儿肺热咳喘颗粒抑菌谱效关系分析

4.1 相关性、灰色关联度分析

以15批小儿肺热咳喘颗粒HPLC特征图谱特征峰峰面积为自变量，相对抑菌活性为因变量，采用SPSS 21.0软件进行Pearson相关性分析，结果发现13个特征峰峰面积与相对抑菌活性均呈正相关，相关系数较大的（≥0.85）依次为9、12、11、2号峰，且除13号峰外相关系数均不小于0.39，提示小儿肺热咳喘颗粒抑制肺炎链球菌的作用可能与其处方中多味药材配伍使用有关，符合中成药多成分协同作用的特点，详见表5。以15批小儿肺热咳喘颗粒HPLC特征图谱13个特征峰峰面积为特征序列变量，相对抑菌活性为母序列变量，导入SPSSPRO数据处理网站（https：//www.spsspro.com/）进行灰色关联度分析，针对数据进行无量纲化处理（均值化），设置分辨系数为0.5，计算灰色关联度值，结果发现各特征峰与相对抑菌活性的关联度为0.743～0.924，关联度值较高的（≥0.85）依次为12、11、9、2号峰，对抑制肺炎链球菌有较大贡献，详见表5。结合相关性分析结果，发现相关性分析结果与灰色关联度分析结果大致吻合，二者前四位排名有所差异但均为2、9、11、12号峰且数值均大于0.85，对抑制肺炎链球菌有较大贡献，提示小儿肺热咳喘颗粒抑制肺炎链球菌的主要成分为2、9、11、12号峰所代表的化学成分，其中2、9、11号峰分别代表绿原酸、黄芩苷、木犀草素。

4.2 谱效关系模型建立

采用SPSS 21.0软件，以小儿肺热咳喘颗粒特征峰峰面积为X，相对抑菌活性为Y，采用多重线性回归建立谱效关系模型。结果，回归方程为Y=－（2.47E-07）X峰1－（3.57E-07）X峰2＋（1.20E-07）X峰3＋（3.81E-07）X峰4－（8.25E-08）X峰5＋（1.11E-07）X峰6－（2.58E-07）X峰7＋（3.90E-07）X峰8＋（4.62E-07）X峰9－（4.82E-07）X峰10－（7.99E-07）X峰11＋（1.71E-07）X峰12－（8.64E-08）X峰13－3.947。

4.3 谱效关系模型验证

另取3批小儿肺热咳喘颗粒（批号分别为2104017、2104018和2101005），分别测定各批次样品的特征峰峰面积和相对抑菌活性，将特征峰峰面积代入“4.2”项下回归方程中，即得相对抑菌活性预测值，并与已知测量值进行比较。结果表明3批小儿肺热咳喘颗粒样品相对抑菌活性的预测值与测量值的相对误差分别为-1.05%、+3.3%、-5.78%，表明建立的谱效关系模型可用于小儿肺热咳喘颗粒抗菌作用的预测与评价。

5 讨论

据相关文献报道，绿原酸可破坏肺炎链球菌的细胞膜，导致该类细菌失去细胞膜保护而实现抑菌[8-9]，黄芩苷和木犀草素对肺炎链球菌有较好的抑菌效果[10-11] ，杨丽萍等[12]研究结果表明银黄煎液及其五级膜截留液中黄芩苷、绿原酸具有体外抑制肺炎链球菌的作用。本研究发现绿原酸、黄芩苷、木犀草素为抑菌主要活性成分，与文献报道相符。

蒋庆佳等[13]认为由于中药具有多成分、多靶点、多通路的特点，其抑菌作用可能由多种成分、多种机制协同发挥起效。研究表明黄芩、锦灯笼[14-15]

对抑菌活性有较大贡献的色谱峰均超过10个。竹叶椒挥发油[16]抗菌主要活性成分有3个，指纹图谱中各色谱峰与抑菌活性的关联度均大于0.78。银翘散抑菌谱效关系[17]中有14个共有峰与抑菌作用密切相关，7个抑菌主要活性成分，与牛黄上清丸[18]数量相同。芩苏胶囊[19]抑制5种致病菌的主要活性成分均超过4个，抑制肺炎链球菌主要活性成分10个。小儿肺热咳喘颗粒各特征峰峰面积与相对抑菌活性均为正相关且除13号峰外不小于0.39，灰色关联度值均大于0.74，表明除抑菌主要活性成分其他成分可能对抑菌起协同作用。

中药质量控制的根本目的是对药效的控制[20]，中成药组分复杂，多数中成药物质基础和作用机制探究仍处于探索阶段[21]。特征图谱是一种对复杂成分中药进行整体质量控制的方法，比起单一的成分检测更适合对中药“多成分-多靶点”的复杂作用机制进行评价，但缺乏与药效的相关性[22]。谱效关系研究是将中药指纹图谱中的化学成分与中药药效联系起来，通过数据分析筛选出与药效密切相关成分的综合评价体系，保留了中医药的整体观念。但受不同研究方法影响，如样品采集波长、制备方法等，单张化学图谱无法完整体现中药的总化学成分，数据处理方法不同也会对结果产生一定影响[23]。

本研究建立了小儿肺热咳喘颗粒抑制肺炎链球菌谱效关系模型并验证，3批样品预测值与测量值的相对误差绝对值均不超过6%，说明此模型可用于预测和评价小儿肺热咳喘颗粒对肺炎链球菌的抑制作用。但特征图谱仍有10个色谱峰未成功指认，需进行结构鉴定，且抑菌作用机制尚不明确，仍需继续研究，以便为小儿肺热咳喘颗粒的临床使用和中药抑菌药物开发提供一定参考[24]。

参 考 文 献

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