分析珍珠粉、茯苓、绞股蓝及其复合物改善小鼠睡眠作用的影响

周子桐 董雪 张雅倩 申文凤 牛子阳 李信心 李伟娜

摘要 目的：分析珍珠粉、茯苓、絞股蓝及其复合物改善小鼠睡眠作用的影响。方法：通过直接睡眠试验、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验、巴比妥钠睡眠潜伏期试验评价其对小鼠睡眠情况的影响，通过急性毒性试验评价珍珠粉茯苓绞股蓝复合物的安全性。结果：珍珠粉、茯苓、绞股蓝及其复合物各剂量组对正常小鼠均无直接睡眠作用，但是复合物各剂量组均可以延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，有统计学意义（P<0.01或P<0.001），增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量入睡小鼠只数（P<0.01），能够显著缩短小鼠的睡眠潜伏期，有统计学意义（P<0.001）。此外，复合物高剂量组小鼠下丘脑及血清中的5-羟色胺（5-HT）及γ-氨基丁酸（GABA）含量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.001）。与珍珠粉、茯苓、绞股蓝比较，复合物在延长戊巴比妥钠睡眠时间、增加小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠只数、缩短巴比妥钠睡眠潜伏期方面效果显著优于各单药组；急性毒性试验表明珍珠粉茯苓绞股蓝复合物对受试小鼠未出现不良反应。结论：以上结果表明，珍珠粉、茯苓、绞股蓝及复合物均可在一定程度上改善小鼠的睡眠，并且珍珠粉、茯苓、绞股蓝组成的复合物具有协同增效的作用，安全性良好。

关键词 珍珠粉；茯苓；绞股蓝；睡眠；戊巴比妥钠；巴比妥钠

Analyzing the Effects of Pearl Powder，Poria Cocos，Gynostemma Pentaphyllum and Their Complexes on Improving Sleep in MiceZHOU Zitong1，2，DONG Xue1，2，ZHANG Yaqian1，2，SHEN Wenfeng1，2，NIU Ziyang1，2，LI Xinxin1，2，LI Weina1，2

（1 School of Chemical Engineering，Northwestern University，Xi′an 710069，China; 2 Shaanxi Biomaterials and Fermentation Engineering Technology Research Center，Xi′an 710069，China）

Abstract Objective：To analyze the effects of pearl powder，Poria cocos，Gynostemma pentaphyllum and their complexes on improving sleep in mice.Methods：The effects of direct sleep test，prolonged pentobarbital sodium sleep time test，pentobarbital sodium subthreshold dose hypnosis test，and pentobarbital sodium sleep latency test on mouse sleep were evaluated，and the safety of pearl powder Poria cocos pentaphyllum complex was evaluated through acute toxicity test.Results：Pearl powder，Poria cocos，Gynostemma pentaphyllum and their complexes did not have a direct sleep effect on normal mice，but each dose group of the complex could prolong the sleep time induced by pentobarbital sodium，with statistical significance（P<0.01 or P<0.001）.The number of sleeping mice was increased with the subliminal hypnotic dose of pentobarbital sodium（P<0.01） could significantly shorten the sleep latency of mice，with statistical significance（P<0.001）.In addition，the levels of 5-hydroxytryptamine（5-HT） in the hypothalamus and serum of mice in the high-dose complex group were also measured γ-The content of aminobutyric acid（GABA） was significantly higher than that of the control group，and the difference was statistically significant（P<0.01 or P<0.001）.Compared with pearl powder，Poria cocos，and Gynostemma pentaphyllum，the complex showed significantly better effects in prolonging pentobarbital sodium sleep time，increasing the number of mice hypnotized by pentobarbital sodium subthreshold dose，and shortening the sleep latency of pentobarbital sodium compared to other single drug groups; the acute toxicity test showed that the pearl powder Poria cocos and Gynostemma pentaphyllum complex did not exhibit any adverse reactions in the tested mice.Conclusion：The above results indicate that pearl powder，Poria cocos，Gynostemma pentaphyllum and their complexes can all improve the sleep of mice to a certain extent，and the complex composed of pearl powder，Poria cocos，and Gynostemma pentaphyllum has a synergistic effect and good safety.

Keywords Pearl powder; Poria cocos; Gynostemma pentaphyllum; Sleep; Pentobarbital sodium; Barbital sodium

中图分类号：R338.63文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2024.02.064

随着社会的发展进步以及人们生活节奏的不断加快，睡眠障碍疾病的发生率大大提高［1］，全球因失眠导致的患病率为25%左右，平均每4个人就会有1个人患病，甚至每天约有2 800人因睡眠障碍死亡［2-3］。睡眠障碍的主要特征为难以入睡，睡眠时间短，睡眠质量差等［4-5］。

现代医学研究认为，改善睡眠的机制主要与调节血清素（5-羟色胺，5-hydroxytryptamine，5-HT）系统、γ-氨基丁酸（γ-aminobu-tyric Acid，GABA）多巴胺（DA）的平衡有关［6］。目前治疗睡眠障碍的药物种类繁多，常以苯二氮艹卓等镇静催眠类药物治疗，但连续用药会出现敏感性降低、药效减弱甚至久用成瘾等问题［7］。面对这些局限，人们倾向于寻求天然药物来治疗或缓解失眠症状。历代医书记载了大量具有改善睡眠功效的中药单味方药，为治疗失眠提供了可借鉴的经验［8］。《中华人民共和国药典》记载，珍珠具有安神定惊作用，且能抑制动物中枢神经系统［9-10］。茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核［9］，是药食两用、临床运用的大宗中药材之一。绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）具有降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和对心肌缺血及缺血再灌注损伤具有保护等多种药理作用［11］。目前关于茯苓、绞股蓝单独改善睡眠的研究较多［12-13］，而珍珠粉的研究则多集中于美容保健［14］，具体的生药起效剂量及对应的人体用量研究相对较少。同时珍珠粉、茯苓、绞股蓝3种中药材的联合助眠作用及其起效剂量的研究也未见详细报道。因此，本试验以小鼠为研究对象，对珍珠粉、茯苓、绞股蓝及其复合物进行改善睡眠功能试验，评价不同配方对失眠小鼠的改善作用，为3种原料及其复合物的实际应用提供理论数据支持。

1 材料与方法

1.1 药物 珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物均购自陕西嘉禾生物科技股份有限公司，其中茯苓水提物提取得率为5%，绞股蓝水提物提取得率为18%。复合物为珍珠粉、茯苓提取物、绞股蓝提取物混合物（珍珠粉∶茯苓∶絞股蓝=2∶5∶15）。

1.2 动物 SPF级昆明小鼠，雌性，体质量（20±2）g，由陕西省西安市西安交通大学医学部实验动物中心提供［许可证号：SCXK（陕）2020-001］。动物饲养于屏障级动物房，温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%，12 h照明和12 h黑暗交替，动物自由摄食和饮水。

1.3 仪器与试剂 计时器、玻璃匀浆器、ME104E/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；BioTek全波长酶标仪，美国伯腾仪器有限公司产品；TGL-20台式高速离心机，山东百欧医疗科技有限公司产品。生理盐水、戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司产品；巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司产品；五羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）和多巴胺（DA）酶联免疫吸附测定（ELSIA）试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。

1.4 治疗方法

1.4.1 动物分组与给药 将100只小鼠按照体质量随机分为10个组，即9个观察组和1个空白对照组，每组10只。以灌胃方式给予受试药物，灌胃量为10 mL/（kg·bw），1次/d，空白对照组给予等量的蒸馏水。设置珍珠粉低、高剂量组，分别按16、32 mg/（kg·bw）给药；茯苓水提物低、高剂量组，分别按40、80 mg/（kg·bw）给药；绞股蓝水提物低、高剂量组，分别按120、240 mg/（kg·bw）给药；复合物低、高剂量组，分别按176、252 mg/（kg·bw）给药。试验期间动物自由摄食饮水，每天观察小鼠的活动及生长情况。灌胃30 d后，对各组小鼠进行相关指标的检测。

1.4.2 直接睡眠试验 末次灌胃15 min后观察小鼠睡眠情况，睡眠以翻正反射消失为指标，即当小鼠置于背卧位时，能够立即翻正身位，如果超过60 s小鼠不能翻正，说明翻正反射消失，小鼠进入睡眠，从翻正反射消失到其恢复的时间为小鼠的睡眠时间。分别观察并计算各组小鼠的入睡只数及睡眠时间。

1.4.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 末次灌胃15 min后，各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/（kg·bw），以翻正反射消失为动物入睡指标，分别记录各组动物的平均睡眠时间。

1.4.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 末次灌胃15 min后，各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠27 mg/（kg·bw），以翻正反射消失为动物入睡指标，分别记录各组30 min内入睡动物只数。

1.4.5 巴比妥钠睡眠潜伏期试验 末次灌胃15 min后，各组小鼠腹腔注射巴比妥钠230 mg/（kg·bw），以翻正反射消失为依据，观察受试物能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期。

1.4.6 脑组织5-HT、GABA、DA含量的检测 各组小鼠连续灌胃30 d后，禁食12 h，处死小鼠，取出脑组织，用生理盐水冲洗后称其质量，用匀浆器制备10%的脑组织匀浆，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明书采用ELISA测定各组小鼠脑组织中5-HT、GABA、DA的含量。

1.4.7 小鼠急性毒性试验 雌、雄小鼠各20只，18～22 g。采用最大耐受剂量法，受试物一次性灌胃给予，染毒剂量为15 g/（kg·bw），以10 mL/（kg·bw）的灌胃容量给予小鼠灌胃。试验前动物禁食（不禁饮水）16 h，记录动物的中毒表现及死亡情况，连续观察14天。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验；计数资料用百分比/率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直接睡眠试验 空白对照组（蒸馏水）、珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物、复合物各剂量组的小鼠均未出现睡眠现象（没有翻正反射消失小鼠），各组均无直接睡眠效果，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 与空白对照组比较，复合物低、高剂量组小鼠戊巴比妥钠睡眠时间均显著延长，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.001），说明复合物可显著延长小鼠睡眠时间。同时，与空白对照组比较，珍珠粉高剂量组、茯苓水提物高剂量组以及绞股蓝水提物高剂量组小鼠的戊巴比妥钠睡眠时间与空白对照组比较显著延长，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与复合物比较，珍珠粉低、高剂量组、茯苓高剂量组、绞股蓝高剂量组睡眠时间存在显著差异，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结果表明复合物各剂量组均可以对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间起到延长作用，且对小鼠睡眠时间的延长作用优于珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物单药组。见表2。

2.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 与空白对照组比较，复合物各剂量组均能显著增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量入睡小鼠只数，差异有统计学意义（P<0.01），茯苓水提物、绞股蓝水提物高剂量组能显著增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量入睡小鼠只数，差异有统计学意义（P<0.05）。与复合物低剂量组比较，珍珠粉低剂量组、茯苓水提物低剂量组、绞股蓝水提物低剂量组入睡小鼠只数存在显著差异，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结果表明，相较于珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物，复合物可以显著增加戊巴比妥钠阈下催眠剂量入睡小鼠只数。见表3。

2.4 巴比妥钠睡眠潜伏期试验 与空白对照组比较复合物各剂量组均能显著缩短小鼠的睡眠潜伏期，差异有统计学意义（P<0.001），说明复合物具有缩短巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期的作用。同时，与空白对照组比较，珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物高剂量组小鼠的睡眠潜伏期均显著缩短，差异有统计学意义（P<0.01）。与复合物低剂量组比较，珍珠粉低剂量组、茯苓水提物低剂量组、绞股蓝水提物低剂量组睡眠潜伏期存在显著差异，差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明，相较于珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物单药组，复合物可以显著缩短小鼠的睡眠潜伏期，对小鼠的睡眠起到一定的改善作用。见表4。

2.5 绞股蓝珍珠粉胶囊对失眠小鼠脑组织5-HT、GABA、DA含量的影响 与空白对照组比较，珍珠粉高剂量组5-HT、GABA显著升高，DA含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；茯苓水提物高剂量组5-HT、GABA含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），DA含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；绞股蓝水提物高剂量组5-HT、GABA含量显著升高（P<0.05或P<0.01），DA含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；复合物各剂量组小鼠脑组织中5-HT、GABA含量表现不同程度的增加，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01或P<0.001），DA含量不同程度降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），与复合物高剂量组比较，珍珠粉高剂量组小鼠脑组织中5-HT含量存在显著差异，差异有统计学意义（P<0.05）；与复合物高剂量组比较，珍珠粉低剂量组、茯苓水提物低剂量组、绞股蓝水提物高剂量组小鼠脑组织中GABA含量存在显著差异，差异有统计学意义（P<0.05）。各指标表现出一定的剂量依赖性关系，且作用效果优于珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物单药组。由上可知，复合物对小鼠的改善睡眠作用可能是通过调节小鼠脑组织中的5-HT、GABA、DA的含量实现的。见表5。

2.6 小鼠的急性毒性试验 各剂量组小鼠在急性毒性试验期间未出现惊厥不安、便秘腹泻或者是竖毛等不良反应，试验过程中无动物死亡，试验前后各组小鼠的体质量。见表6。给药前后各时间段动物的体质量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。试验结束后，小鼠各脏器并未發现肉眼可见异常，说明珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物及其复合物的安全性良好。小鼠的急性毒性试验经口耐受剂量（MTD）＞15 g/（kg·bw），珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物及其复合物急性毒性属实际无毒级。

3 讨论

本研究为探讨珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物复合物对小鼠的改善睡眠作用及其可能作用机制，通过延长戊巴比妥钠睡眠时间、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验、巴比妥钠睡眠潜伏期试验观察了珍珠粉、茯苓水提物、绞股蓝水提物及复合物对小鼠睡眠的作用并对小鼠脑组织中的5-HT、GABA、DA含量进行了测定，结果显示复合物176 mg/kg、252 mg/kg剂量下对小鼠的改善睡眠作用明显，此时小鼠脑组织的5-HT、GABA含量与空白对照组相比显著升高（P<0.05或P<0.01或P<0.001），DA水平也显著低于空白对照组（P<0.05或P<0.01）。说明珍珠粉茯苓绞股蓝复合物对小鼠的改善睡眠作用可能是通过5-HT、GABA、DA等多种神经递质的共同调节来实现的。复合物小鼠的急性毒性试验经口耐受剂量MTD＞15 g/（kg·bw），试验中雌、雄大鼠各剂量组的体质理与对照组比较均无统计学差异，未见毒性。说明该复合物配方在此剂量范围内是安全的。

珍珠作为一种名贵的中药材，在我国的应用已有几千年的历史。王丽云［15］按保健食品检验与评价技术规范要求，观察超细珍珠粉对小鼠改善睡眠作用，结果表明超细珍珠粉与阈下剂量的戊巴比妥钠有协同作用，一定剂量时可缩短小鼠巴比妥钠的入睡潜伏期。潘建新等［10］研究了珍珠对中枢神经系统的抑制作用，指出珍珠粉可以使小鼠5-HT水平升高，发挥改善睡眠的作用。茯苓的主要成分为茯苓多糖，孙梦娜等［12］研究发现茯苓多糖能不同程度地改善小鼠睡眠情况；李明玉等［16］证明茯苓多糖具有协同戊巴比妥的中枢神经系统抑制作用，起到催眠、安神功效。绞股蓝皂苷作为绞股蓝的主要成分，可以降低正常小鼠的自发活动，还可以加强戊巴比妥钠对中枢神经系统的抑制作用［17］。这与本试验单方的结果一致，且本试验证明复合物改善睡眠的效果显著优于单方。但本试验对复合物设置浓度梯度较少，不能得出具体最低见效剂量，还需进一步深入探究，以便进一步揭示珍珠粉、茯苓、绞股蓝复合物改善小鼠睡眠的作用机制及作用与剂量的关系。

利益冲突声明：无。

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基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFC2101500；2019YFA0905200）作者简介：周子桐（2000—），男，硕士研究生，研究方向：制药工程，E-mail：zztbrilliant@163.com通信作者：李伟娜（1987—），女，副教授，E-mail：zhencheng874125@163.com