去泛素化酶USP20与胆固醇结石

钟睿梓 张悦 黄晓珺

【摘要】 胆固醇结石作为胆囊结石中发生率最高的一种结石，其形成机制可能与胆固醇代谢相关。泛素化是一种能够调控蛋白及蛋白底物，以及介導蛋白降解的蛋白修饰作用，对细胞具有重要的生理学作用，而去泛素化酶（DUBs）是一种去除泛素化以达到影响蛋白质功能的酶，目前泛素特异性蛋白酶20（USP20）作为一种去泛素化酶，可以通过对脂代谢关键限速酶起到去泛素化作用而影响血中胆固醇的含量。本文主要对胆固醇结石的形成、DUBs及泛素特异性蛋白酶（USPs）与疾病的关联进行综述，并探讨USP20对胆固醇的影响及其与胆固醇结石之间可能存在的关联。

【关键词】 泛素化 去泛素化酶 泛素特异性蛋白酶20 胆囊结石 胆固醇结石

Deubiquitinating Enzyme USP20 and Cholesterol Stone/ZHONG Ruizi， ZHANG Yue， HUANG Xiaojun. //Medical Innovation of China， 2024， 21（02）： -183

[Abstract] Cholesterol stone is the most common type of gallstone， and its formation mechanism may be related to cholesterol metabolism. Ubiquitination is a kind of protein modification that can regulate proteins and protein substrates and mediate protein degradation， and has important physiological effects on cells. Deubiquitination enzyme is an enzyme that removes ubiquitination to affect protein function， currently， ubiquitin specific protease 20 （USP20）， as a deubiquitinating enzyme （DUBs）， can affect the content of cholesterol in blood by deubiquitinating key rate-limiting enzyme of lipid metabolism. In this paper， the formation of cholesterol stone， the relationship between DUBs and ubiquitin specific protease （USPs） and diseases were reviewed， and the influence of USP20 on cholesterol and its possible relationship with cholesterol stone were discussed.

[Key words] Ubiquitination Deubiquitylating enzyme USP20 Gallstone Cholesterol stone

First-author's address： Jinan University， Guangzhou 510632， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.02.041

胆囊结石在全球都是常见的多发病，其中美洲土著人是全球胆囊结石患病率最高的人群，在欧洲约有20%的成年人发病，而在中国不同地区，胆囊结石发病率在3%～11%。胆囊结石患病率会随着年龄增长而上升，且女性的患病率比男性高[1-2]。在各类胆囊结石中，胆固醇结石占所有胆囊结石的80%～90%，因此研究胆固醇结石的成因对预防及治疗胆囊结石至关重要。胆固醇结石的主要成分是胆固醇，有研究发现胆固醇代谢的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶与胆固醇结石的形成密切相关[3]。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）家族可以通过降解抑制蛋白质的泛素过程来影响不同类型的通路及蛋白功能，从而对不同的良恶性疾病产生影响。有实验发现，在缺乏泛素特异性蛋白酶20（USP20）基因的小鼠体内HMG-CoA还原酶的稳定性降低，并证明了USP20可以通过影响HMG-CoA还原酶来调节胆固醇的合成[4]。本文将介绍胆固醇与胆固醇结石的关系、DUBs家族，阐述与胆固醇代谢相关的USP20对体内胆固醇代谢的影响，并对USP20在胆固醇结石形成中的作用进行展望。

1 胆固醇结石与胆固醇代谢

1.1 胆固醇结石发病机制概述

胆囊结石是位于胆囊内不易溶解于胆汁的大小不一的结石，大致可以分为胆固醇结石、胆色素结石、混合结石。其中胆固醇结石是以胆固醇为主要成分的胆囊结石。胆汁是一种水溶液，其主要成分为胆盐，占胆汁的67%，其余成分还包括22%的磷脂及4%的胆固醇，三者相互作用形成微泡及微胶粒溶解于胆汁中。正常情况下，三者处于平衡状态，若胆固醇的含量过多或胆盐及磷脂的含量过少，胆固醇的超饱和现象就会出现并随着胆固醇析出形成胆固醇结晶，在黏蛋白等成核因素的作用下形成胆固醇结石[5-6]。此外，胆囊的收缩功能障碍、胆汁凝血纤溶功能、血中胆固醇代谢、逆向转运对体内胆固醇的清除、促成核因子都对胆固醇结石的形成有不同程度的影响[7]。同时，雌激素、肥胖、糖尿病、肠道菌群等也与胆固醇结石形成有着密切关系[1，8]。在基因层面上，一般认为存在六类与胆囊结石形成相关的基因[9]。第一类为肝脏脂类代谢酶，其中HMG-CoA还原酶的基因通过编码胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶来提高患者体内HMG-CoA还原酶的mRNA水平，而CYP1A1基因可编码限速酶胆固醇7α-羟化酶。第二类为脂蛋白受体及相关蛋白，例如低密度脂蛋白受体、B族Ⅰ型清道夫受体等相关编码基因及其他载脂蛋白编码基因。第三类为肝脏及肠道细胞内脂类转运器。第四类为肝脏及肠道细胞膜脂类转运器。第五类为肝脏脂类调节转录因子，主要在转录水平下调控胆固醇的代谢。第六类为胆囊收缩素及相关受体和与结石形成密切相关的黏蛋白。六大类胆囊结石形成相关基因中，有五种相关基因与肝脏及肝细胞内外的脂类合成、代谢、转运相关，由此可以看出脂类合成、代谢与转运在基因水平上对胆固醇结石形成起到重要作用。

1.2 胆固醇代谢/HMG-CoA还原酶影响胆固醇结石形成

在胆固醇结石最近的研究进展中，有學者认为肝脏胆固醇的高分泌与过饱和胆汁是胆固醇结石形成的重要因素[10]。胆固醇生物合成途径存在3个关键角色，分别为作为胆固醇生物合成主转录调节因子的固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2），以及生物合成途径中的两个限速酶HMG-CoA还原酶和角鲨烯单加氧酶[11]。

有药物层面研究发现作用于HMG-CoA还原酶远端的胆固醇生物合成抑制剂在胆结石易感C57L小鼠饲喂致石饲料后可以防止胆固醇结石的形成[12]。同时依折麦布通过有效减少肠道胆固醇吸收和胆汁胆固醇分泌来预防胆结石，并通过降低胆汁饱和度来保护胆汁的运动功能，并通过形成大量的不饱和胆汁促进胆结石的溶解。此外，依折麦布显著降低胆结石患者胆汁中的胆固醇饱和度和延缓胆固醇结晶，即在药物层面可通过减少胆固醇合成或作用于HMG-CoA降低胆固醇结石的发生率[13]。在基因层面，有研究将HMG-CoA还原酶的短发夹RNA（shRNA）克隆到表达载体上，使shRNA在动物体内稳定持久地表达，从而持久抑制靶基因的mRNA表达[14]。而其中shRNA-3表达质粒载体明显抑制HMG-CoA还原酶的表达，且shRNA-3组的成石率明显降低，说明在基因层面抑制HMG-CoA还原酶的表达可有效抑制结石的形成。综上可见HMG-CoA还原酶与结石形成关系密切。

2 DUBs的功能、组成及在疾病中的作用

2.1 泛素化与去泛素化

翻译后修饰（PTM）是一种复杂的生物学功能调控机制，其对细胞培育、应激反应起到重要作用。细胞内的蛋白质在翻译后通常会受到如磷酸化、甲基化、乙酰化及泛素化等类型的修饰，其中泛素化负责调控蛋白之间的相互作用、蛋白底物的酶激活及蛋白酶介导的蛋白降解。已有实验证明通过泛素化介导的蛋白质降解通路是维持真核细胞蛋白平衡的重要途径之一[15]。因此蛋白泛素化修饰在多种生物学现象中起到重要的调节作用。作为一个动态可逆的过程，蛋白质的泛素化修饰可以被特异的酶去除，其通过切断泛素C末端尾部与目标赖氨酸之间的异肽键，从而影响蛋白质的功能，这一过程称为去泛素化，而这种具有特殊功能的酶被称为DUBs[16]。DUBs不仅可以通过不同泛素链接方式选择性地切割底物蛋白的泛素部分，同时DUBs也可以根据本身不同类型的催化结构域分为依赖氨基酸三联体、结构与半胱氨酸蛋白酶相似的泛素特异性蛋白酶（USPs）、泛素羧基末端水解酶（UCHs）、卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTUs）、Josephins家族和依赖锌的JAB1/MPN/MOV34金属蛋白酶（JAMMs）家族[17-18]。同时近年来一种拥有独特折叠方式的蛋白家族——Mindy家族被确认为第六种DUBs的新成员[19]。

2.2 DUBs与疾病的关系

大多数DUBs不仅在正常的细胞中发挥作用，也被证明与多种疾病有关，包括癌症、糖尿病、神经退行性疾病和传染病。去泛素化可以在酶、转录因子、信号转导分子、病毒蛋白、免疫反应蛋白、许多细胞内环境稳态的调节器及已知的癌基因或抑癌基因的表达产物上发挥作用。许多研究已经表明DUBs也可以通过调节转化生长因子-β（TGF-β）、蛋白激酶B（PKB）、核因子κB（NF-κB）和其他癌症相关通路的调节，例如USP7的异常激活及USP4与结直肠癌相关，其中USP4能在许多类型的肿瘤中表达，被认为是一个潜在的致癌基因。另外USP14的过度表达也能导致肝癌的发生。虽然大部分DUBs能促进肿瘤的发生，但也有一些DUBs可以起到抑制肿瘤的功能，如圆柱瘤蛋白（CYLD）可以通过作用于DVL底物来抑制多发性骨髓瘤的表达[16]。因此，以DUBs为方向的治疗策略不仅具有广泛的开发价值，也拥有着良好的开发前景。

3 USPs及USP20与疾病的关系

3.1 DUBs中最大的家族——USPs

在人体中USPs家族拥有56个蛋白酶成员，是DUBs六大家族中成员最大的家族[19]，可见USPs在人体中发挥着重要的生物学功能。USPs还参与多种与生物过程相关的分子信号通路，包括DNA损伤修复、p53和TGF-β途径。近年来USPs作为潜在的治疗靶点引起了越来越多的关注。所有的USPs都包含一个保守的催化结构域，该结构域会被一个或多个附加结构域所包绕，例如与泛素相关的DUSP结构域和N-末端锌指泛素结构域（ZnF-UBP）。USPs家族的功能障碍会导致癌症、自身免疫性疾病、神经退行性病变等疾病的发生与发展[20]。MDM2是一种与肿瘤抑制因子p53结合，促进p53肿瘤抑制蛋白降解的泛素连接酶，USP17作为一种特异性的蛋白水解酶，可以通过同时稳定p53和MDM2从而调控肿瘤的发生。USP2a的过表达通过泛素化稳定MDM2-p53从而抑制MDM2介导的p53泛素化，最终导致p53的降解从而促进肿瘤的发生与发展[15]。PPP1CA是蛋白磷酸酶1三个亚基之一，其通过MAPK通路促进结直肠癌细胞的生长与转移，而过表达的USP11在结直肠癌中可以抑制PPP1CA的降解来促进结直肠癌的发生。另外USP14作为酵母菌UBP6的同源基因，其活性在与蛋白酶体结合时增强，并反过来抑制整体蛋白酶的功能。目前在免疫组化分析中USP14在肺癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌上过度表达[21]。有研究发现敲除USP14基因会使AKT和ERK信号通路失活，而AKT诱导的磷酸化可以激活USP14来减弱蛋白质的降解作用促进肿瘤细胞的增殖[22-23]。由此可以看出，USP家族与肿瘤进展的机制有着重要的关联及意义，为通过调节USPs家族来调控肿瘤的发生发展提供了重要的研究基础。USPs家族不仅对癌症的发生起到重要作用，在炎症性肠病、肺纤维化等疾病中也能通过相关的信号通路对疾病的发生起到正性或负性的影响[24-25]。

3.2 疾病中的USP20

USP20作为USPs家族的一员，近年来发现其在肿瘤、脂质代谢[4]和神经系统疾病中表现出新的生理作用，并因其在药物开发与药物治疗中的潜力而受到越来越多的关注。研究发现USP20在结直肠癌中存在着高表达，同时高表达的还有β-catenin，USP20通过去泛素β-catenin使β-catenin在不被降解的情况下进入细胞核，β-catenin与淋巴增强因子和T细胞因子结合，激活其基因转录，从而促进肿瘤的增殖与侵袭[26]。在乳腺癌中，USP20去泛素化转录抑制因子SNAI2来调控乳腺癌细胞的侵袭和转移[27]。MCL1是抗凋亡B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）蛋白家族的重要成员，在细胞的增殖、分化中发挥着重要作用，在食管癌中USP20可以通过去泛素化稳定MCL1在食管癌中稳定表达，从而使肿瘤细胞对化疗药产生耐药性[28]。USP20还可以通过稳定相关基因组的信号通路及由于基因缺失导致肿瘤发生的相关基因来抑制肿瘤的发生。可以看出USP20对于肿瘤存在促进及抑制两个方面的调控作用[29-30]。USP20的作用不仅限于肿瘤，在其他疾病中也存在相关的调控。在神经炎症中，USP20的过表达可以减弱神经炎症因子的表达及抑制NF-κB相关炎症信号的增强通路从而缓解神经炎症反应和减少神经元的死亡，此外当受到HSV-1感染时，USP20可以稳定相关免疫介质，免疫介质通过激活下游炎症通路促进细胞抗病毒的反应作用[31]。USP20还与代谢性疾病、心力衰竭等疾病的调控密切相关[32-33]，可以看出USP20在调控各类良恶性疾病的发生与发展中扮演着重要的角色。

3.3 USP20与胆固醇结石

HMG-CoA还原酶是胆固醇代谢中的关键酶，如前文所述，高脂血症小鼠极易诱发胆固醇结石，发现在摄食状态下，USP20可以稳定胆固醇生物合成途径中的限速酶HMG-CoA还原酶，餐后胰岛素和葡萄糖浓度的增加可刺激mTORC1在S132和S134处磷酸化USP20，并使USP20与HMG-CoA还原酶结合达到抑制HMG-CoA还原酶降解的目的[4]。该研究还通过高营养饲料喂养肝脏特异性USP20缺失的小鼠与将USP20（S132A/S134A）基因敲入的小鼠，发现在USP20缺失小鼠中HMG-CoA还原酶的稳定性较USP20基因敲入小鼠的稳定性更低。另外，通过将小鼠禁食后向其腹膜注射葡萄糖或胰岛素，检测血中血糖及胰岛素的变化，并利用胰岛素信号通路中mTOR、ATK相关抑制剂进行实验发现，肝脏中USP20的水平保持不变而HMG-CoA还原酶在葡萄糖和胰岛素的协同作用下表达升高，同时在使用mTOR、ATK抑制剂后USP20介导的HMG-CoA还原酶存在累积上升的现象。USP20可能对mTORC1下游的胰岛素和葡萄糖产生反应。此外，该实验还发现mTOCR1在再摄食导致高血糖的过程中还可以使S132和S134残基上的USP20磷酸化。最后在USP20的特异性抑制剂作用于小鼠的实验中发现，该抑制剂不仅抑制了肝脏中USP20的表达，还导致HMG-CoA还原酶稳定性降低，使肝脏、血清和脂肪组织中的脂质水平降低。该研究揭示了一个由USP20磷酸化作用调控，从mTORC1到HMG-CoA还原酶的调节途径，并表明USP20的抑制剂可以用来降低胆固醇水平，而且还可以通过产生琥珀酸来增加能量消耗。近年来人们逐渐发现，USP20对于胆固醇代谢的调控可以用于治疗包括高脂血症、肝脂肪变性、肥胖和糖尿病在内的代谢性疾病[20]。由此我们可以看出，在以高胆固醇为基础所致的胆囊结石（尤以胆固醇结石为主）的发病机制或许也受USP20的调控。

4 小结与展望

DUBs家族与各类疾病息息相关，作为DUBs家族中最大家族的一员，USP20通过与HMG-CoA相互作用来保持胆固醇合成途径关键酶HMG-CoA还原酶的稳定，并间接通过经典途径提高血中胆固醇含量，而血中胆固醇含量与胆固醇结石的形成存在直接关系，综上我们可以合理推测DUBs家族中的USP20在调节胆固醇代谢方面与胆固醇结石的形成具有一定的相关性。但是目前有关USP20与胆固醇关系的研究仅停留在小鼠实验，且尚没有实验表明USP20提高胆固醇含量与胆固醇结石的形成存在直接关联，在DUBs家族与胆固醇结石形成方面国内外还处于空白，我们希望有相关实验能填补这一空白，探索USP20是否能成为下一个预防及治疗胆固醇结石的重要靶点。

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（收稿日期：2023-05-12） （本文編辑：陈韵）