实时荧光PCR法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的研究

庞婕 刘杰 孔庆岩 秦森翰 董建锋

摘 要：近年来，包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的现象时有发生，运用国家安全标准方法进行检验，过程烦琐，周期较长，不利于监管。然而，实时荧光PCR检验法具有灵敏、快速、准确等优点，被广泛应用于各种检验检测中。本文采用实时荧光PCR法，利用特异性引物和探针对目标基因进行扩增。然后通过实时荧光PCR法对其他5种细菌和梯度含量的铜绿假单胞菌菌悬液进行检测，验证方法的特异性和灵敏度。结果表明，只有铜绿假單胞菌的实时荧光PCR检测结果为阳性，其他细菌的检测结果为阴性，说明本方法对铜绿假单胞菌的特异性较好，方法的灵敏度为1×103 CFU·mL-1。同国家安全标准方法相比，实时荧光PCR法所用时间更短，明显提高了检测效率。

关键词：铜绿假单胞菌；实时荧光PCR；包装饮用水

Abstract： In recent years， the phenomenon of excessive levels of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water has occurred. The use of national safety standard methods for inspection is cumbersome and time-consuming， which is not conducive to supervision. However， the real-time fluorescence PCR detection method has the advantages of sensitivity， speed， and accuracy， and is widely used in various testing methods. In this paper， real-time fluorescent PCR was used to amplify the target gene with specific primers and probes. Then， the other 5 kinds of bacteria and the gradient content of Pseudomonas aeruginosa suspensions were detected by real-time fluorescent PCR to verify the specificity and sensitivity of the method. The results showed that only Pseudomonas aeruginosa was positively detected by real-time fluorescent PCR， while the detection results of other bacteria were negative， indicating that the specificity of this method for Pseudomonas aeruginosa was good， and the sensitivity of this method was 1×103 CFU·mL-1. Compared with the national safety standard method， the real-time fluorescent PCR method takes less time and significantly improves the detection efficiency.

Keywords： Pseudomonas aeruginosa; real-time fluorescent quantitative PCR; packaged drinking water

铜绿假单胞菌，又叫绿脓杆菌，是在自然界中广泛分布的一种致病菌，可能引起多种感染，包括皮肤、眼睛、肺部和尿路感染等[1]。因此，评价水体中微生物污染状况的重要指标为是否含有铜绿假单胞菌。

《食品安全国家标准包装饮用水》（GB 19298—2014）中要求铜绿假单胞菌的检测方法为《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2022）。该方法为传统微生物法，是将水中细菌截留在滤膜后，用灭菌镊子夹取滤膜，移放在假单胞菌琼脂平板上培养后，分离纯化，再进行确证试验。全部实验总时长最短为48 h，最长可达96 h。同时确证试验包括绿脓菌素试验、产氨试验、42 ℃生长试验、氧化酶试验和金氏B培养基试验，整体操作过程较为烦琐，并且需要消耗大量的人力物力资源，检测速度慢，工作效率低下。随着分子生物技术的高速发展，PCR技术具有快速、简便、准确的优势，已经在病毒和细菌的快速检测中得到了广泛的应用[2]。本研究采用实时荧光PCR法对包装饮用水中的铜绿假单胞菌进行检测，同时运用5种常见标准菌株对该方法的特异性、灵敏度、重复性等进行验证，并将试验结果同《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2022）中铜绿假单胞菌的检测结果进行比较，验证方法的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

标准菌株：铜绿假单胞菌（ATCC27853）、沙门氏菌（ATCC14028）、荧光假单胞菌（ATCC13525）、单增李斯特氏菌（ATCC19111）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923），环凯生物[3]。

脑心浸萃液态培养基，杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒、铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒，广州双螺旋基因技术有限公司。

全自动生化鉴定系统（VITEK 2 Compact System），生物梅里埃美国股份有限公司；BIO-RAD（CFX96）实时荧光PCR仪，美国伯乐；BSC-1000IIA2生物安全柜，上海析牛莱伯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准菌株的活化

将铜绿假单胞菌等6种标准菌株按照标准菌种使用说明书进行活化，即将西林瓶表面用75%乙醇擦拭消毒后，在无菌条件下打开西林瓶，加入复苏液（脑心浸萃液态培养基），制成悬浮液。用生理盐水对菌悬液进行梯度稀释，形成梯度含菌量为1×107 CFU·mL-1、1×106 CFU·mL-1、1×105 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1、1×103 CFU·mL-1、1×102 CFU·mL-1和1×10 CFU·mL-1的菌悬液。

1.2.2 模板的提取

用无菌吸管吸取1 mL菌悬液，用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取细菌基因组DNA，涡旋振荡混匀，100 ℃下加热5～10 min，所得上清液即为提取的核酸基因组，作为扩增模板。

1.2.3 特异性引物和探针

参照《出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增（RAA）检测方法 第12部分：铜绿假单胞菌》（SN/T 5516.12—2023）[4]，铜绿假单胞菌检测所用引物和探针如表1所示。

1.2.4 实时荧光PCR扩增

（1）添加模板。实时荧光扩增反应体系为50 μL，其中缓冲液25 μL，上游引物2.0 μL，下游引物2.0 μL，探针1.0 μL，DNA模板5.0 μL，双蒸水15.0 μL[5]。反应用各种试剂均已分装于购买的商品化试剂盒中。将试剂盒置于室温中，等各组分试剂解冻后，用涡旋混匀器混匀，离心30 s，分装于0.2 mL PCR管中。向分装好的PCR管中分别加入5 ?L模板，以双蒸水为空白对照，以目的基因lasB为阳性对照，顺序为空白对照、待测样品模板、阳性对照，离心30 s，立即进行扩增反应。

（2）反应程序。荧光基团选择Fam，淬灭基团选择None。去污染：37 ℃，10 min，一个循环；预变性：95 ℃，1 min，一个循环；扩增：95 ℃，15 s；60 ℃，30 s，40个循环。

1.2.5 结果判断

Ct值=0或≥40，扩增曲线为一条直线或者轻微斜线，则样品检测结果为阴性，即不含有铜绿假单胞菌[6]。Ct值≤36，扩增曲线呈“S”型，则样品检测结果为阳性，即含有铜绿假单胞菌。36＜Ct值＜40，需进行一次重复实验，若Ct值≥40则为阴性，不含有铜绿假单胞菌；否则为阳性，含有铜绿假单胞菌。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR特异性检测结果

将6种标准菌株进行活化、培养后，按照1.2.2的方法提取模板，进行实时荧光PCR扩增，每个标准菌株进行2次重复试验。如图1所示，只有铜绿假单胞菌的检测结果为阳性，其余5种菌株均为阴性。说明本研究采用的实时荧光PCR方法具有良好的特异性，不会引起非特异性扩增。

2.2 实时荧光PCR灵敏性检测结果

分别取浓度为1×107 CFU·mL-1、1×106 CFU·mL-1、1×105 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1、1×103 CFU·mL-1、1×102 CFU·mL-1和1×10 CFU·mL-1的铜绿假单胞菌菌悬液1 mL，按照1.2.2的方法提取模板，再进行实时荧光PCR检测。如图2所示，浓度为1×107 CFU·mL-1、1×106 CFU·mL-1、1×105 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1、1×103 CFU·mL-1的菌悬液均有扩增曲线，浓度为1×102 CFU·mL-1、1×10 CFU·mL-1的菌悬液均无扩增曲线，表明该实时荧光PCR检测方法最低检测浓度为1×103 CFU·mL-1。

2.3 实时荧光PCR重复性测试结果

根据《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）选取将铜绿假单胞菌浓度为1×106 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1的菌悬液，按照1.2.2的方法提取DNA后，进行实时荧光PCR检测。每种浓度的菌悬液分别进行10次重复试验，将扩增结果的Ct值记录下来并计算变异系数。如表2所示，试验建立的实时荧光PCR方法具有良好的重复性。

2.4 实时荧光PCR方法与国家安全标准方法检测结果的比较

将铜绿假单胞菌标准菌株活化后，分别用实时荧光PCR方法和国家安全标准方法《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2022）对其进行检测，重复试验7次，进行结果比较[7]。结果显示，实时荧光PCR方法与国标法的重复性试验检测结果相似，说明该研究建立的实时荧光PCR方法具有较高的精确度，可以应用于实际检测当中。

2.5 实际样品检验

采用本试验建立的实时荧光PCR方法对承德地区生产的10个不同品牌的包装饮用水进行检测。结果显示，有一个样品检出有铜绿假单胞菌，其他样品均未检出，说明本试验建立的实时荧光PCR方法具有良好的实用性。

3 结论与讨论

本研究采用实时荧光PCR法对铜绿假单胞菌进行检测，同时与其他5种常见致病菌的特异性检测进行比对。结果表明，该方法对铜绿假单胞菌的特异性好，能排除其他致病菌的干扰。检测限为1×103 CFU·mL-1。此外，本研究同时采用实时荧光PCR法与国家安全标准方法对铜绿假单胞菌进行重复性试验，检测结果相似，表明本研究建立的实时荧光PCR方法具有较高的精确度和良好的实用性。相比国家安全标准方法而言，实时荧光PCR法具有检测效率高、易于操作和灵敏度高等特点，在食品检验检测中可得到广泛的应用。即将实施的《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2023）中增加了实时荧光PCR法，并作为第二法。实时荧光PCR技术作为一种检测手段具有很大的实际运用价值，随着科学技术的不断发展，实时荧光PCR检测方法也将得到进一步的发展和完善，并在微生物检测中得到更多的应用。

参考文献

[1]孟嘉伟.饮用天然矿泉水源中铜绿假单胞菌污染防治研究[J].中文科技期刊数据库（文摘版）工程技术，2017（1）：72.

[2]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京：人民军医出版社，2007.

[3]王芳妹，徐月，林丹，等.包装饮用水中铜绿假单胞菌实时荧光定量PCR快速检测[J].食品与机械，2023（6）：75-80.

[4]中华人民共和国海关总署.出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增（RAA）检测方法 第12部分：铜绿假单胞菌：SN/T 5516.12—2023[S/OL].（2023-05-05）[2024-01-15].http：//www.csres.com/detail/391792.html.

[5]王丹，李赫婧，薛晨玉，等.基于實时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌[J].食品安全质量检测学报，2023，14（10）：301-306.

[6]张惟材，朱力，王玉飞.实时荧光定量PCR[M].北京：化学工业出版社，2016.

[7]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法：GB 8538—2022[S].北京：中国标准出版社，2022.

基金项目：承德市科技计划项目（202303A167）。

作者简介：庞婕（1986—），女，河北承德人，本科，工程师。研究方向：食品检验检测。

通信作者：刘杰（1989—），男，河北承德人，本科，工程师。研究方向：食品药品检验。E-mail：425504383@qq.com。