受体酪氨酸激酶Mer对高糖环境培养的大鼠雪旺细胞系RSC96增殖调控作用观察

付怡丹，陈文婷，苏晓杨，赵燕，兰丹凤，杨秋萍

1 昆明医科大学第一附属医院干部医疗科，昆明 650032；2 昆明医科大学第一附属医院重症医学科；3 昆明医科大学第一附属医院糖尿病科；4 云南省第一人民医院消化内科；5 昆明医科大学第一附属医院内分泌一科

糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）是糖尿病最常见的慢性并发症，也是糖尿病患者致死、致残的重要原因。我们前期研究[1］发现，DPN 患者外周血及DPN 小鼠坐骨神经中均存在受体酪氨酸激酶Mer（Mer receptertyroshin kinase，Mertk）高表达。Mertk 是Tyro3、Axl 和Mertk（TAM）受体酪氨酸激酶家族的成员之一，广泛表达于神经细胞和神经胶质细胞等细胞中[2］，能通过促进抗炎性细胞因子白细胞介素10（IL-10）、IL-13 和IL-4 的表达和分泌，抑制促炎性细胞因子IL-12、干扰素和核转录因子（NF-κb）的表达，抑制炎症信号的转导[3］。DPN 作为一种源于糖尿病的进行性疾病，疾病特征与细胞所处的慢性高糖环境有密切关系。高糖暴露可导致构成神经纤维髓鞘的雪旺细胞损伤甚至凋亡，使周围神经纤维发生脱髓鞘病变[4］，还会影响雪旺细胞的增殖[5］，因此明确高糖环境培养下Mertk 对雪旺细胞增殖的调控作用机制具有积极意义。为此，2023 年1-9 月，我们观察了Mertk 对高糖环境培养大鼠雪旺细胞系RSC96 增殖的调控作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 大鼠雪旺细胞系RSC96源于昆明医科大学科技成果孵化中心细胞库，保存于-80 ℃超低温冰箱。RSC96 细胞采用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM 培养基，放置在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。生长状态良好的细胞形态应为神经元样贴壁细胞。培养基内酚红的颜色变为黄色，或更换另一种培养基做造模处理时，需要对细胞进行换液处理。当细胞密度达到80%以上，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按照1∶2或1∶3的比例传代培养。DMEM培养基（葡萄糖浓度4.5 g/L D-Glucose，货号8122258）、胎牛血清及青霉素-链霉素双抗，含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液均购自GIBCO 公司；无水葡萄糖购自广州光华科技股份有限公司；RNA 转染试剂（GP-Transfect-Mate）及siRNA， 均购自GenePharma公司；BCA 试剂盒及EDU 试剂盒均购自Beyotime 公司；Mertk 一抗购自Abcam 公司（Cat No. ab184086），实验其余相关一抗、二抗，均购自Proteintech 公司（P65：Cat No. 10745-1-AP；β-actin：Cat No. 81115-1-RR；TNF-α：Cat No. 60291-1-Ig；二 抗：SA0001/SA0002）；CCK-8检测试剂购自Biosharp公司。

1.2 葡萄糖浓度及培养时间筛选

1.2.1 不同高糖浓度培养的RSC96 细胞中Mertk检测 取生长状态良好的RSC96 细胞，分为一、二、三、四、五组。首先使用不添加10%胎牛血清的DMEM培养基换液（正常葡萄糖浓度为25 mmol/L），置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中饥饿处理4 h。二、三、四、五组分别置换为50、75、100 及125 mmol/L 葡萄糖浓度的DMEM 培养基，继续培养48 h。采用Western Blotting 法检测各组细胞Mertk。最终筛选出Mertk 蛋白相对表达量最高的葡萄糖浓度，即100 mmol/L为后续受试浓度。

1.2.2 不同高糖培养时间的RSC96 细胞中Mertk检测 取生长良好的RSC96 细胞，先使用无10%胎牛血清的DMEM 培养基饥饿处理4 h，置换为“1.2.1”所筛选得到的100 mmol/L 葡萄糖浓度的培养基中，分别于培养0、24、36、48、60 h 时取各组细胞，采用Western Blotting 法检测各组细胞Mertk。检测后发现48、60 h 两组细胞Mertk 表达增加。然而60 h 组虽然Mertk 表达量高，但培养过程中细胞数量少、形态差、细胞碎片多，不利于后续siRNA 敲降实验开展。综合以上两项实验，最终选择葡萄糖100 mmol/L及培养48 h为后续实验条件。

1.3 高糖培养条件下敲降Mertk基因表达的RSC96细胞增殖情况观察及Mertk、NF-κb通路蛋白检测

1.3.1 细胞分组、高糖及siRNA给予方法 将雪旺细胞随机分为对照组、高糖组、高糖敲降组及敲降组。高糖组细胞先使用无10%胎牛血清的DMEM培养饥饿处理4 h，置换为100 mmol/L葡萄糖浓度的培养基。高糖敲降组先使用无10%胎牛血清的DMEM培养饥饿处理4 h，置换为100 mmol/L 葡萄糖浓度的培养基，同时加入5 μL 的敲降Mertk 基因表达的siRNA（GenePharma 公司定制，正义链GAGGAAAGAUACAUCUUAATT，反 义 链UUAAGAUGUAUCUUUCCUCTT）。敲降组细胞先使用无10%胎牛血清的DMEM 培养饥饿处理4 h 后仅加入5 μL 的 siRNA。对照组细胞不做特殊处理。

1.3.2 各组细胞细胞增殖活力检测 采用Edu法。取各组细胞，以细胞培养基：Edu 原液=500∶1 的比例配制2x EdU 工作液，每孔按照500 μL 培养基+500 μL 2x EdU 工作液的培养体系在37 ℃孵育2 h；固定液室温孵育30 min，通透液室温孵育30 min；避光配制Click 反应液，室温孵育30 min；避光配制Hoechet 工作液，室温孵育10 min；湿润状态下于荧光显微镜下测算细胞增殖活力。实验重复测算3次，取平均值。

1.3.3 各组细胞Mertk 及NF-κb 通路蛋白P65、TNF-α 表达检测 培养48 h 时取各组细胞，采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk、P65、TNF-α。取出制备好的细胞，以RIPA∶PMSF=100∶1配置裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃ 14 000 g 离心20 min，取上清液。BCA 法测定样品总蛋白浓度。将组织蛋白95 ℃变性并上样到SDS-PAGE 胶，垂直电泳60 V、30 min，120 V、60 min使蛋白分离，转膜仪280 mA将蛋白转至PVDF 膜，经5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入Mertk（1∶1 000）、P65（1∶1 000）、TNF-α（1∶4 000）一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶4 000）室温孵育1 h，化学发光成像系统采集条带图像并分析条带灰度值，以β-actin 为内参照。实验重复测算3 次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov法，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同葡萄糖浓度培养的RSC96 细胞中Mertk表达量比较 不同葡萄糖浓度培养的RSC96 细胞Mertk 相对表达量比较 一、二、三、四、五组细胞Mertk 蛋白相对表达量分别为0.60 ± 0.20、0.78 ±0.19、0.81 ± 0.06、0.95 ± 0.09、0.87 ± 0.11。与一组相比，四、五组细胞Mertk 蛋白相对表达量高（P均＜0.05）。

2.2 不同高糖培养时间RSC96 细胞Mertk 相对表达量比较 在100 mmol/L 葡萄糖浓度培养0、24、36、48、60 h 时RSC96 细胞Mertk 相对表达量分别为0.56 ± 0.31、0.70 ± 0.26、0.78 ± 0.35、0.96 ±0.09、1.53 ± 0.09。与培养0 h 相比，培养48、60 h时RSC96细胞Mertk相对表达量高（P均＜0.05）。

2.3 各组细胞增殖活力比较 高糖敲降组、敲降组、高糖组及对照组细胞增殖活力分别为0.23 ±0.02、0.33 ± 0.13、0.19 ± 0.06、0.26 ± 0.04（%）。与对照组相比，高糖组细胞增殖活力低（P＜0.05），敲降组细胞增殖活力高（P＜0.05）。

2.4 各组细胞Mertk、P65、TNF-α 相对表达量比较 各组细胞Mertk、P65、TNF-α相对表达量比较见表1。

表1 各组细胞Mertk、P65、TNF-α相对表达量比较（± s）

表1 各组细胞Mertk、P65、TNF-α相对表达量比较（± s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别高糖敲降组敲降组高糖组对照组TNF-α 1.07 ± 0.17*0.83 ± 0.06*0.80 ± 0.13*0.41 ± 0.20 Mertk 0.81 ± 0.11 0.54 ± 0.20*1.10 ± 0.12*0.79 ± 0.21 P65 1.39 ± 0.31*0.93 ± 0.08*1.15 ± 0.50*0.57 ± 0.18

3 讨论

DPN 是糖尿病最常见的并发症之一，在患者确诊糖尿病后5、10 和20 年时DPN 的发病率分别约为30%、60%和90%，已呈现高发态势[6-7］。DPN可最终导致神经纤维丢失、疼痛、足部溃疡和截肢等问题，生活质量下降，加重社会负担[8-9］。其病理生理机制复杂，诊断及治疗较为困难，因此寻找有效的调控靶点具有积极意义。

雪旺细胞是探讨DPN 的经典体外模型[10］。雪旺细胞作为周围神经系统中最重要的髓鞘细胞，不仅参与维持周围神经的正常结构和功能[11］，还涉及DPN 炎症反应等多种病理过程[12］。我们首先在雪旺细胞中筛选出了Mertk 蛋白相对表达量最高的葡萄糖浓度（100 mmol/L）和高糖培养时间（48 h）。这一结果说明在高糖环境中长时间培养下Mertk 表达水平提高。OCHODNICKY 等[13］的研究也表明，糖尿病患者可溶性TAM 受体（sMertk 等）的循环和尿液水平升高，这与我们前期研究[1］结果一致。结合上述研究，可推测雪旺细胞内Mertk 表达水平升高可能在DPN 疾病进程中发挥重要作用。然而，在本研究中Mertk 基因表达升高的原因尚不清楚，结合本文对Mertk 作用机制的研究，我们推测机体应对神经炎性损伤、调控Mertk升高以保护神经。

在表型研究[14］中，高糖环境中的RSC96 细胞增殖活力明显下降，推测与糖尿病复杂的生物能量学和代谢组学特征相关，糖尿病可使创口迁延不愈，增殖、重塑缓慢[15］，高糖对雪旺细胞的作用机制有待进一步研究讨论。Mertk 对细胞增殖活力的调控范围广泛，例如巨噬细胞上的TAM 受体是癌肿增殖抑制的兴奋靶点[16］，神经挤压损伤模型中Mertk 有利于细胞的修复[17］。对Mertk行敲降处理后，RSC96细胞增殖活性增加，结合后续对Mertk调控NF-κb通路的研究，推测敲降Mertk可能通过促进细胞P65、TNF-α表达，促进高糖培养条件下RSC96 细胞的增殖，具体机制有待进一步研究。

在100 mmol/L、培养48 h 的高糖环境培养下对雪旺细胞内Mertk基因行敲降处理后，发现NF-κb信号传导通路的重要环节P65、TNF-α 蛋白表达量也随之提高，高糖环境和Mertk 敲减处理均可以提高P65 和其下游炎症因子TNF-α 的表达水平，表明高糖环境Mertk表达下降可上调NF-κb通路，对雪旺细胞炎症反应过程发挥影响。有研究表明，TAM 抑制具有促炎作用[18］，其中Mertk 在介导PI3K/AKT 和NF-κb 通路调控中起着重要作用[19］。NF-κb 与DPN的病理生理机制有关[7］，经典的NF-κb 系统是由细胞质内IκB 抑制的亚基p50 和P65 组成的复合体。以糖尿病为代表的不同的刺激，可导致IκB 的磷酸化，然后降解，进而允许P50 和P65 向细胞核发出信号，激活大量有关基因。NF-κb 通路调控的促炎细胞因子是神经血管损伤和神经传导速度受损的主要原因，抑制NF-κb通路，有望降低炎性细胞因子的表达，最终改善神经损伤[20］。因此，Mertk 在高糖环境雪旺细胞中的表达上调，并调控NF-κb 通路，可对DPN临床诊断和靶向调控有积极启发。

本研究仍存在局限性，如细胞实验无法模拟体内环境，单一变量控制葡萄糖浓度及作用时间的方法无法避免渗透压等因素变化带来的影响，需要结合动物模型及临床进一步验证。

综上所述，随高糖培养时间的延长，RSC96细胞内Mertk 表达逐渐增加。高糖培养条件下敲降Mertk 基因表达的RSC96 细胞增殖活力高，细胞P65、TNF-α 表达升高。Mertk 可能通过促进细胞P65、TNF-α 表达，促进高糖培养条件下RSC96 细胞的增殖。