非小细胞肺癌组织中组蛋白去乙酰化酶7、泛素特异性肽酶10的表达变化及其意义

张帆，杨鹏，郝振叶，巨宽心，李颉

1太原钢铁（集团）有限公司总医院呼吸内科，太原 030008；2太原钢铁（集团）有限公司总医院风湿免疫科

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，全球每年新增患者182.5 万例、死亡约159 万例[1］。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer， NSCLC）是最常见的肺癌类型，可分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。以手术治疗为主的综合治疗是目前临床常用的NSCLC治疗方法，但由于NSCLC 的肿瘤异质性较高，相同分期或不同治疗方法的患者疗效及预后差异较大[2］。因此，研究NSCLC发生发展的具体机制，寻找准确评估患者预后的肿瘤标志物，指导临床治疗方案的选择，具有重要临床意义。组蛋白去乙酰化酶7（histone deacetylase 7，HDAC7）属于组蛋白去甲基化蛋白酶家族成员，参与转录调控、细胞周期进展和细胞发育分化等过程。近年研究发现，黑色素瘤[3］、结直肠癌[4］等肿瘤中HDAC7能够通过上调c-Myc等癌基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖和转移。泛素特异性肽酶10（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10，USP10）是半胱氨酸蛋白酶家族成员，能特异性地切割结合蛋白质的泛素分子，参与细胞周期调控、自噬、增殖、迁移及耐药等[5-7］。目前NSCLC 组织中HDAC7、USP10 表达相关研究报道较少。为此，我们观察了NSCLC 组织中HDAC7、USP10 表达变化，探讨其临床意义，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018 年4 月—2020 年4 月我院收治的NSCLC 患者98 例。纳入标准：①原发性肺癌，经CT 引导下肺穿刺活检术后病理明确诊断为NSCLC，后经全身评估为早到中期，由我院呼吸科转入胸外科进一步手术治疗，术中保留癌组织及癌旁组织（距离癌组织5 cm 以上的正常肺组织），术后按《中国临床肿瘤学会肺癌诊疗指南》推荐给予标准化化疗4～6 个周期；②术前患者未接受任何治疗；③患者均已签署知情同意书；④临床资料完整。排除标准：①有其它恶性肿瘤病史；②有结核病史、免疫系统疾病及其它严重感染；③合并心、肺、肝、肾等脏器异常；④有精神疾病病史。98 例患者中男58例、女40 例；年龄34～78（65.17 ± 6.19）岁；病理类型为腺癌62 例，鳞状细胞癌36 例；TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期63 例，Ⅲ期35 例；肿瘤高中分化56 例，低分化42 例；淋巴结转移33 例。本研究已通过医院伦理审查。

1.2 NSCLC 癌 组 织 癌 旁 组 织HDAC7、USP10 检测 采用免疫组织化学法。将NSCLC 癌组织和癌旁组织10%组织固定液固定16 h，石蜡包埋切片，厚度为3 μm，70 ℃温箱内溶蜡2 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱苯处理，柠檬酸盐溶液中高压锅抗原热修复。自然冷却后用3%双氧水室温避光孵育15 min。3%羊血清封闭2 h。滴加HDAC7、USP10一抗后（购自美国abcam 公司，货号ab137366，ab109219），浓度为1∶200，4 ℃孵育过夜。滴加兔/鼠通用型二抗室温孵育30 min。所有切片在室温下用DAB 显色5 min，苏木素染色，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，晾干后中性树脂封片。显微镜拍照（日本奥林巴斯公司，型号SPM-20）。以已有的HDAC7 和USP10 结肠癌阳性膜片作为阳性对照，反应过程中用磷酸盐缓冲液替换一抗作为阴性对照。由两位病理医生在同一显微镜下观察染色结果，有争议时讨论做出判断。NSCLC 癌组织中HDAC7，USP10 棕黄色阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，部分位于细胞核。在400×的高倍光学显微镜物镜下，随机选取5 个高倍视野，取每个视野的平均值作为阳性细胞的百分比，阳性细胞的百分比标准为：肿瘤细胞0%～5%染色计0 分、6%～30%染色计1 分、30%～60%染色计2 分、60%以上染色计3 分；染色强度标准为肿瘤细胞无染色计0 分、浅黄色计1 分、棕黄色计2 分、棕褐色计3 分。以阳性细胞的百分比与染色强度的乘积为最终评分，乘积≥2 分者判为阳性、＜2 分者判为阴性。

1.3 NSCLC 患者的随访方法 98 例患者术后均进行电话和门诊随访。随访内容涵盖患者生存情况、术后治疗方案及近期复查结果等。随访3年，每3～6 个月随访1 次。随访截止至2023 年5 月。随访终点为患者死亡或随访结束。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料用%表示，组间采用χ2检验；采用Spearman相关性分析法分析NSCLC 癌组织中HDAC7 与USP10 表达的相关性；采用Kaplan-Meier 生存曲线分析HDAC7、USP10 表达与NSCLC 患者预后的关系，以NSCLC 患者是否死亡为因变量，自变量包括HDAC7表达、USP10 表达、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM 分期；采用COX 多因素比例风险模型分析NSCLC 患者预后的影响因素。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 癌组织和癌旁组织HDAC7、USP10 阳性表达率比较 NSCLC组织、癌旁组织中HDAC7阳性率分别为65.31%（64/98）、6.12%（6/98）（χ2=74.756，P＜0.05）；NSCLC 组织、癌旁组织中USP10阳性率分别为63.27%（62/98）、8.16%（8/98）（χ2=64.800，P＜0.05）。

2.2 NSCLC 癌组织中HDAC7、USP10 表达的相关性 NSCLC 癌组织中HDAC7 与USP10 表达呈正相关（r=0.714，P＜0.05）。

2.3 不同临床病理参数的NSCLC 患者HDAC7、USP10表达情况 不同临床病理参数的NSCLC患者HDAC7、USP10 表达情况见表1。不同肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM 分期的NSCLC 患者癌组织HDAC7 和USP10 表达阳性率比较，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。不同年龄、性别、病理类型及肿瘤直径之间比较，差异无明显统计学意义（P均＞0.05）。

表1 不同临床病理参数的NSCLC 患者HDAC7、USP10表达情况（例）

2.4 不 同HDAC7、USP10 表 达 的NSCLC 患 者 预后情况比较 89 例患者随访过程中失访2 例、死亡39 例，3 年总生存率为60.20%（59/98）。HDAC7阳性、阴性患者3 年总生存率分别为45.31%（29/64），88.24%（30/34）。USP10 阳性、阴性患者3 年 总 生 存 率 分 别 为43.55%（27/62），88.89%（32/36）。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，与表达阴性者比较，HDAC7、USP10 阳性的NSCLC患者3 年累积生存率低（χ2=16.300、15.870，P均＜0.05）。

2.5 NSCLC患者预后的影响因素COX回归 NSCLC患者预后的多因素COX 回归分析结果见表2。COX 回归分析结果显示，HDAC7 阳性、USP10 阳性、肿瘤低分化程度、有淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ期是影响NSCLC 患者预后的独立危险因素（P均＜0.05）。

表2 NSCLC患者预后的多因素COX回归分析结果

3 讨论

NSCLC 早期症状不明显，2/3 的患者确诊时已处于晚期。尽管随着医疗水平的提高，肺癌靶向治疗和免疫治疗的发展，肺癌患者的远期生存预后仍然较差[8］。既往对NSCLC患者预后评估主要基于临床特征、病理类型及肿瘤TNM 分期等，但由于肿瘤异质性，在判断患者预后中的准确性不高[9］。深入研究NSCLC 疾病机制，探讨NSCLC 预后影响因素，评估个体患者的生存期，对于改善患者临床诊治及延长生存时间具有重要意义。

组蛋白的乙酰化/去乙酰化修饰是表观遗传学调控的重要机制，能够多步骤、多层次调节染色质结构和基因转录[10］。HDAC7 是组蛋白去乙酰化酶Ⅱa类家族成员，能够通过与转录因子相互作用，募集到特定的基因区域发挥表达调控作用[11］。研究发现，HDAC7通过转录起始位点和超级增强子的组蛋白3赖氨酸27 乙酰化修饰，促进肿瘤细胞干性特征维持，进而参与肿瘤细胞增殖及肿瘤的发生[12］。本研究中，HDAC7 在NSCLC 患者癌组织中表达升高，与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM 分期有关，表明HDAC7参与NSCLC的发生发展。研究表明，NSCLC肿瘤细胞中长非编码RNA OPA 相互作用蛋白5 反义RNA1 能够抑制微小RNA-140-5p 的表达，进而增加HDAC7 mRNA 的稳定性，导致HDAC7 蛋白表达升高，HDAC7 能够诱导血管内皮生长因子A 的表达，促进淋巴管生成，促进肿瘤细胞的淋巴转移[13］。另外，HDAC7是内皮祖细胞诱导的新生血管形成中的关键调节因子，促进肿瘤血管新生及肿瘤增殖转移[13］。实验研究[14］发现，敲除NSCLC 肿瘤细胞中HDAC7的表达后，肿瘤细胞外信号调节激酶去磷酸化，抗血管生成基因如内皮抑素等的表达增加，进而抑制肿瘤血管管腔的形成。本研究中，HDAC7阳性NSCLC 患者预后较差，提示HDAC7 是新的评估NSCLC 预后的肿瘤标志物。分析其原因，可能与HDAC7 参与促进化疗耐药性形成有关。研究[15］表明，HDAC7 与MYC 结合到人有机阳离子转运蛋白OCT2 启动子处，增加OCT2 启动子基因处组蛋白3赖氨酸18 和27 位点的乙酰化修饰水平，激活OCT2的表达，导致肿瘤细胞对奥沙利铂等化疗耐药性的形成。利用HDAC7 抑制剂TMP195 能够诱导布鲁顿酪氨酸激酶的高乙酰化，增强单核细胞衍生的巨噬细胞的抗肿瘤效应，增强慢性淋巴细胞白血病患者抗体治疗的有效性[16］。因此，HDAC7的表达促进NSCLC 肿瘤的发生发展，是评估患者预后的肿瘤标志物，以HDAC7 为靶点的治疗是潜在的NSCLC 治疗方案。

USP10 是去泛素化酶家族成员，能够将细胞质中多种蛋白去泛素化，调节细胞增殖、凋亡及自噬。研究报道，USP10在肝癌[17］、前列腺癌[18］等多种肿瘤组织中高表达，其通过帮助中细胞从上皮性表型转化为间充质细胞，提高肿瘤细胞转移、侵袭能力。本研究中，NSCLC 中USP10 表达升高，提示USP10 参与NSCLC 的肿瘤进展。NSCLC 中USP10 的表达上调与缺氧有关。缺血缺氧状态可导致肿瘤组织缺氧诱导因子1α 转录上调，进一步上调USP10 的表达，USP10 能够阻止抑癌因子p53 进入肿瘤细胞核，促进 肿 瘤 恶 性 进 展[19］。本 研 究 中，USP10 表 达 与NSCLC 患者的不良临床病理特征有关，表明USP10促进NSCLC 肿瘤进展。研究发现，恶性肿瘤中的c-Myc 可诱导USP10 的转 录，介导p14ARF 的去泛素化，增强p14ARF 蛋白的稳定性，促进肿瘤细胞的发生及恶性转化[20］。此外，USP10 能够直接与Yes 相关蛋白/TAZ 相互作用，通过去泛素化来稳定Yes 相关蛋白/TAZ，激活下游c-myc 等癌基因的表达，促进肝细胞癌等恶性肿瘤的增殖和转移[6］。在本研究中，USP10 阳性表达的NSCLC 患者预后较差，表明USP10 是新的评估NSCLC 预后的肿瘤标志物。研究发现，USP10 能够与组蛋白去乙酰化酶6 相互作用，促进P53 基因突变的NSCLC 肿瘤细胞对顺铂等铂类化疗药耐药性形成，导致患者不良预后[21］。有 学 者[22］报 道，USP10 的 特 异 性 抑 制 剂Spautin-1 能够抑制黑色素瘤细胞凋亡，促进活性氧介导的DNA 损伤，与顺铂等化疗药物发挥协同抗肿瘤效应。本研究显示，NSCLC 中HDAC7 与USP10 表达呈显著正相关，提示两者可能存在相互作用关系。有学者[23］证实，NSCLC 中USP10 能够与促进HDAC7 去泛素化，增强HDAC7 的稳定性，HDAC7 一方面通过上调成纤维生长因子18 的表达，促进NSCLC 肿瘤细胞的增殖。另一方面与β-连环蛋白的相互作用，降低β-连环蛋白Lys49 的乙酰化水平，促进β-连环蛋白的核转移，增强肿瘤细胞的侵袭和迁移。

本研究中，低分化程度是影响NSCLC 患者预后的独立危险因素。低分化的NSCLC 肿瘤细胞恶性程度高，增殖能力强，肿瘤生长速度快，肿瘤容易侵犯周围组织，发生血管及淋巴结转移，导致患者不良预后。NSCLC 患者淋巴结转移是影响NSCLC 患者预后的重要因素，这与既往研究中淋巴结清扫的数量和范围能够显著改善早期NSCLC 患者的无复发生存率和总生存率的结果一致[24］。TNM 分期系统是临床上预测NSCLC 患者预后的重要依据，对于TNM 分期Ⅲ期NSCLC 患者，肿瘤负荷大，肿瘤细胞的侵袭和转移能力强，术后肿瘤复发和转移的风险较高，患者远期生存预后较差。

综上所述， NSCLC 癌组 织 中HDAC7、USP10表达升高，HDAC7、USP10 阳性表达与NSCLC 患者的不良临床病理特征及不良预后有关。HDAC7、USP10 可能作为新的NSCLC 预后相关肿瘤标志物。但本研究纳入样本量较小，未对不同临床病理特征的NSCLC 患者进行分层分析，也未深入研究HDAC7、USP10 在NSCLC 发展中的具体作用机制，未来需要进一步的基础和临床实验进行探索。