黄芩素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 侵袭、迁移、上皮间充质转化的调控作用及其机制

陈林，梁秋果，吉杨丹，王恒

1 黔南民族医学高等专科学校基础医学部，贵州都匀 558013；2 黔南州天然产物与组分功效重点实验室

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均呈年轻化趋势发展，并逐年上升[1］。乳腺上皮细胞发生恶性增殖后易形成远端转移，乳腺癌发生转移后患者的生存率明显降低[2］。上皮间充质转化（EMT），是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程[3］。在肿瘤的转移中发挥重要作用，其主要的特征为细胞黏附分子E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等[4］。整合素av及整合素β3为整合素家族成员之一，是指细胞与细胞或细胞与细胞外基质相关联的细胞膜表面的一类跨膜粘附分子，其在成熟血管内皮、上皮细胞及正常细胞中表达较低或无表达[5］，但在肺癌、黑色素瘤和乳腺癌等[6-8］多种肿瘤细胞或组织中均呈高表达，与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。研究[9］发现，整合素αv 及整合素β3 高表达能够增强乳腺癌细胞的侵袭转移能力，反之，抑制整合素αv 及整合素β3 表达可抑制乳腺癌细胞的侵袭、转移。进一步研究[10］发现，整合素αv 及整合素β3 的异常活化会激活黏着斑激酶（FAK），活化的FAK 使下游磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）磷酸化，导致细胞-细胞粘附和顶端基底外侧的丧失，增强肿瘤细胞的迁移侵袭能力。黄芩素（Bai）是中药黄芩的主要活性单体成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化应激及抗血栓等多种药理学作用[11-12］。最新研究[13］发现，黄芩素具有较强的体内外抗肿瘤活性，且不良反应较小。黄岑素是否能抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移，目前相关研究较少。为此，我们观察了黄芩素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭、迁移及EMT 的影响，并进一步探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 MDA-MB-231 购自中国科学院昆明细胞生物研究所，用DMEM/F12培养基，培养基中添加了10%胎牛血清（FBS，美国Gibco）、1%的100 U/mL青霉素（美国Gibco）和1%的100 μg/mL链霉素（美国Gibco）。细胞培养条件为37 ℃和5%CO2。Fibronectin（FN，#F2006）和黄芩素购自美国Sigma-Aldrich 公司；Cyclo（-RGDfK）购自上海威环生物科技有限公司；Matrigel（#356237）购自美国BD Biosciences 公司。培养基DMEM/F-12 和胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）来自美国Hyclone 公司。SDS-PAGE 凝胶制备试剂购自北京Solarbio 公司。抗 体：E-cadherin（R868）、vimentin（I444）、P-FAK（#BS4684）、phosphorylated-PI3K（#AP0152）、PI3K（Y46/Y199）、GAPDH（1A6）、goat anti-mouse IgG HRP（BS12478）和goat anti-rabbit IgG HRP（BS13278）购自美国Bio-World 公司。Anti-integri alpha V（EPR16800）（ab179475）抗 体 购 自Abcam 公 司。Anti-integri β3（B-7）（sc-46655）、FAK（#sc-557）抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 MDA-MB-231细胞分组及黄岑素给予方法 取对数生长期 MDA-MB-231 细胞，培养在12 孔培养板中，直至90%的密度。将MDA-MB-231 细胞分为一组、二组、三组及对照组，每组6个复孔，一组、二组、三组分别加入2.5、5、10 μmol/L的黄岑素，对照组不做任何处理，培养48 h备用。

1.3 各组细胞迁移、侵袭能力观察 培养48 h 时取各组细胞，采用划痕修复实验观察四组细胞迁移能力、采用Transwell 侵袭实验观察四组细胞侵袭能力。细胞划痕修复实验：取四组细胞培养于12 孔培养板中。使用10 μL 的移液器吸头板孔中间进行划伤，并在Leica DMI 1 显微镜下，以50×放大倍数拍照，分别在0、48 h 进行拍照，并计算细胞迁移率（细胞迁移率 = 初始划痕宽度- 48 h 后划痕宽度/ 初始划痕宽度×100%）。细胞侵袭实验：将Matrigel 胶（从-20 ℃拿出放在4 ℃解冻），按照说明书的方法配置Matrigel胶，将其混匀后加到Transwell小室中，放入培养箱中（40 min），然后将制备好的Transwell 小室（8 μm 孔径）转移到含有10%FBS 的培养基的24 孔板中（1 mL/孔）。培养48 h 将各组细胞以5×105/mL 分别接种到Transwell 小室中（400 μL 细胞悬液），放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，取出Transwell 小室，弃去小室中的培养基，用棉签轻轻将Transwell 小室上层未侵袭的细胞蘸掉。4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗，用HE 染液进行染色。通过倒置显微镜（100×放大率）拍照，测算四组侵袭细胞数。实验均重复3 次，取平均值。

1.4 各组细胞vimentin、E-cadherin、整合素αv、整合素β3、FAK 及PI3K 检测 采用Western Blotting法。培养48 h 时取四组细胞，用RIPA 裂解液（Lysis：PIC：PMSF=99∶1∶1）裂解收集细胞，4 ℃下12 000 r/min离心20 min。吸取上清液，转移至事先预冷的EP 管中，即为提取的蛋白。按照BCA 蛋白测定试剂盒的说明书进行蛋白定量分装，通过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，与整合素αv、整合素β3、p-FAK、FAK、p-PI3K、PI3K、E-cadherin、vimentin 的特异性一抗在4 ℃孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育1.5 h。最后，使用ChemiDoc XRS +系统和图像实验室软件（5.2版，Bio-Rad）对结果进行分析，以GAPDH蛋白作为内参，以蛋白条带灰度值代表目的蛋白的相对表达量。实验重复测算3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS24 统计软件。采用K-S 检验进行正态分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组细胞迁移率、侵袭细胞数比较 培养48 h时四组细胞迁移率、侵袭细胞数比较见表1。

表1 培养48 h时四组细胞侵袭、迁移能力比较（± s）

表1 培养48 h时四组细胞侵袭、迁移能力比较（± s）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与一组相比，＃P ＜0.05；与二组相比，ΔP ＜0.05。

侵袭细胞数（个）1 632 ± 250 700 ± 50*＃373 ± 12*＃Δ 1 833 ± 252组别一组二组三组对照组细胞迁移率（%）0.71 ± 0.06*0.50 ± 0.05*＃0.39 ± 0.02*＃Δ 0.86 ± 0.05

2.2 各组细胞vimentin、E-cadherin 相对表达量比较 培养48 h 时各组细胞vimentin、E-cadherin 相对表达量比较见表2。

表2 培养48 h时各组细胞vimentin、E-cadherin相对表达量比较（± s）

表2 培养48 h时各组细胞vimentin、E-cadherin相对表达量比较（± s）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与一组相比，＃P ＜0.05；与二组相比，ΔP ＜0.05。

E-cadherin 177 ± 7*246 ± 14*＃344 ± 30*＃Δ 100 ± 12组别一组二组三组对照组vimentin 95 ± 13*54 ± 8*＃43 ± 9*＃Δ 100 ± 17

2.3 各组细 胞整合素αv、整合素β3、p-FAK 及p-PI3K 相对表达量比较 各组细胞整合素αv、整合素β3、p-FAK及p-PI3K相对表达量比较见表3。

表3 培养48 h时四组细胞整合素αv、整合素β3、p-FAK及p-PI3K相对表达量比较（± s）

表3 培养48 h时四组细胞整合素αv、整合素β3、p-FAK及p-PI3K相对表达量比较（± s）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与一组相比，＃P ＜0.05；与二组相比，ΔP ＜0.05。

p-PI3K 93 ± 6*49 ± 12*＃38 ± 14*＃Δ 100 ± 7组别一组二组三组对照组αv 93 ± 8 64 ± 12*＃53 ± 7*＃Δ 100 ± 4 β3 97 ± 10*48 ± 12*＃33 ± 6*＃Δ 100 ± 7 p-FAK 69 ± 10*50 ± 11*＃37 ± 9*＃Δ 100 ± 5

3 讨论

乳腺癌细胞的侵袭和转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移是提高乳腺癌患者生存率的关键。乳腺癌细胞的侵袭转移与EMT 密切相关[14］。肿瘤细胞的EMT 是癌症恶化和转移的主要推动力，同时也是决定乳腺癌进展程度的关键因素。在EMT 过程中，细胞经历从原有的粘附性、非流动性、卵圆形上皮表型向可移动、侵袭性长梭形间质表型的转变，伴随E-cadherin 表达下调，而间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin 和Snail的表达上调[15］。因此，抑制EMT 的发生成为阻止乳腺癌细胞侵袭和转移的关键靶点，有望显著提高乳腺癌患者的存活率。深入研究和干预EMT 过程，尤其是通过调节E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail等分子的表达，可能为开发更有效的治疗策略提供重要线索，从而为乳腺癌的个体化治疗和预防提供新的思路。

MDA-MB-231 是一种人三阴性乳腺癌细胞系，表现出极强的侵袭和转移能力，常被用作乳腺癌研究的模型。这种细胞缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2，具有高度恶性的特征，使其成为探索癌症侵袭机制和药物治疗策略的重要工具。因此，本研选用MDA-MB-231细胞为研究对象。黄芩素对多种癌症，包括乳腺癌，具有显著的抗肿瘤作用[13］。在我们的研究中发现，黄芩素能够显著抑制DA-MB-231细胞的侵袭转移能力，上调E-cadherin表达，下调vimentin蛋白表达。该结果表明，黄芩素对人乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞的迁移、侵袭以及EMT 相关标志蛋白的表达均具有显著的逆转作用，提示了黄芩素可能能作为预防乳腺癌侵袭转移的潜在药物。

整合素是位于细胞表面的异二聚体粘附受体，参与调控细胞的多个生理过程，包括细胞的增殖、分化、粘附和迁移[16］。肿瘤细胞的迁移过程依赖于肿瘤细胞与基质的附着，而这一关键过程主要由整合素家族的黏附分子介导[17］。特别是整合素αv 及整合素β3，在肿瘤细胞中相对于其在正常组织或细胞中的表达量显著提高[5］。整合素αv 及整合素β3 在肿瘤细胞的EMT 过程和侵袭转移中起到关键作用。高表达的整合素αv 及整合素β3 促进乳腺癌细胞发生EMT，而通过降低整合素αv 及整合素β3 的表达可以发挥抑制作用，逆转乳腺癌细胞的EMT 过程，从而有效地抑制细胞的迁移和侵袭能力[8］。在本研究中，黄芩素能够使MDA-MB-231 细胞中整合素αv和整合素β3蛋白表达下调，提示黄芩素可能通过调控整合素αv 及整合素β3 来影响乳腺癌细胞的EMT过程，从而抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

整合素αv 及整合素β3 以配体特异性的方式激活细胞迁移和细胞内信号，FAK 是这一过程中的重要蛋白[18］。FAK 是一种非受体酪氨酸激酶，作为整合素信号传导的中心下游效应物，参与胞内多条信号通路的传导，在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用。FAK 的磷酸化促进肿瘤细胞EMT 的发生和肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增强[19］。FAK 和PI3K 是促进肿瘤细胞EMT 和转移的共同途径。研究[20］表明，磷酸化的FAK通过激活下游信号PI3K促进肿瘤细胞EMT 的发生和迁移侵袭能力的增强。整合素激活FAK后，活化PI3K通路参与多种肿瘤的增殖、迁移和血管生成[21］。已有研究[8］表明，整合素αvβ3/FAK/PI3K/AKT 信号传导介导乳腺细胞癌EMT 的发生。本研究结果发现，黄芩素能够抑制肿瘤细胞中P-FAK、P-PI3K磷酸化蛋白表达，表明黄芩素对整合素αvβ3/FAK/PI3K 信号通路的活化起到抑制作用。

综上所述，黄芩素能在人乳腺癌细胞MDA-MB-231的EMT过程中表现出明显的抑制作用，同时显著降低了这些细胞的侵袭和转移能力。其可能的作用机制可能与抑制整合素αvβ3/FAK/PI3K 信号通路有关。