与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因筛选及其在骨骼肌组织中表达观察

徐锐，李燕燕，徐红

1 新疆维吾尔自治区人民医院老年医学中心，乌鲁木齐 830000；2 新疆维吾尔自治区人民医院心脏外科

随年龄增加人类逐渐出现骨骼肌质量、肌力及功能的下降，这种在老年人群中普遍存在而又极易被忽视的临床病征被称为老年肌肉衰减综合征，简称肌少症。肌少症患者常出现平衡能力下降、跌倒及骨折等，严重影响老年人的生活质量，同时给社会造成严重的经济负担。数据[1］显示，2050年全世界肌少症患者将超过5亿。既往研究[2］认为，肌少症的发生发展可能与运动神经元退化或丢失、蛋白质合成下降或异常、性激素水平降低、炎症反应、氧化应激、肥胖、肠道菌群、胰岛素抵抗、心力衰竭、及糖尿病等慢性消耗性疾病有关。最新研究发[3］现，肌少症的发生与线粒体自噬相关。线粒体自噬是指线粒体通过自噬溶酶体系统降将功能障碍的线粒体进行降解，从而达到对线粒体的质量控制，避免机体受到线粒体损伤所带来的不良后果[4］。线粒体自噬减弱后，受损的线粒体在细胞内囤积，产生大量的活性氧簇（ROS），激活泛素—蛋白酶体系统，最终影响骨骼肌的蛋白代谢，故线粒体自噬在骨骼肌的稳态平衡调控中发挥重要作用[5-6］。我们前期研究[7］发现，肌少症大鼠的骨骼肌线粒体自噬信号通路 AMPK/ULK1 表达下调，线粒体自噬水平降低。但线粒体自噬在老年肌少症发病中的确切病理生理机制仍不明确。因此，识别更多的与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因，有助于研究老年肌少症发病的具体作用机制，从而对肌少症进行早期诊断，进一步制订个体化的诊疗方案。为此，2023年1—11月，我们基于数据库数据筛选与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因，并观察其在骨骼肌组织中的表达变化，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因筛选

1.1.1 肌少症发病的差异表达基因筛选 在基因表达数据库（Gene expression omnibus，GEO）搜索“肌少症”，筛选得到GSE1428 和GSE136344 基因表达图谱，GSE1428 基因表达图谱（实验平台为 GPL96）包含10 例正常青年的骨骼肌组织和12 例肌少症患者的骨骼肌组织转录组数据。GSE136344基因表达图谱（实验平台为 GPL5175）包含11 例正常青年的骨骼肌组织和19 例肌少症患者的骨骼肌组织的转录组数据。使用GEO2R 软件汇总两个GSE1428 和GSE136344基因表达图谱中所有肌少症发病的差异表达基因，使用R 软件limma 包筛选肌少症发病的差异表达基因（PValue＜0.05，∣logFC∣＞1）。

1.1.2 线粒体自噬相关基因筛选 以“线粒体自噬”为关键词，从GeneCard 数据库中进行检索，筛选相关性评分＞1分的线粒体自噬相关基因。

1.1.3 与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因筛选 使用“VennDiagram”包将肌少症发病的差异表达基因与线粒体自噬相关基因取交集，最终得到与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因。

1.2 与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因的生物学功能分析 使用R 软件“clusterProfiler”包运用基因本体论（Gene ontology，GO）和京都基因与基因百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因的生物学功能。 富集阈值设置为 FDR ＜ 0.05，并将富集结果进行可视化。GO 分析分别从生物过程 （Biological process，BP）、细胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）对差异基因进行富集。

1.3 与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因筛选 将与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因导入STRING 网站（https：//www. string-db. org），绘制差异表达基因的蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），置信度为 0.4（Confidence=0.4），去除离散的蛋白。

通过Cytoscape 软件中的MCODE 插件对PPI 互作用网络中的蛋白进行功能模块分析。利用Cytoscape中的cytoHubba插件采用Degree算法对与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因进行赋分，选出排名前10 的基因即为与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因。

1.4 与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因验证 用GSE136344基因表达图谱为验证数据集，收集与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因在肌少症、健康查体者骨骼肌组织中的表达资料，采用ggplot2 包并绘制靶点基因功能相似的箱型图验证与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因筛选结果 从GEO2R 软件中筛选肌少症发病的差异表达基因2 242个，其中表达上调的基因30个、表达下调的基因2 212 个。从GeneCards 软件中得到线粒体自噬相关基因845 个。二者取交集后最终得到与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因99 个，包括线粒体内膜蛋白基因（Inner membrane protein， IMMT）、动态蛋白1 样蛋白基因（Dynamin 1 Like，DNM1L）、ATP 合酶F1 亚基α 基因（ATP Synthase F1 Subunit Alpha，ATP5A1）等。

2.2 与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因的生物学功能 KEGG 分析结果显示，与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因主要富集于神经变性途径—多种疾病（pathways of neurodegeneration-multiple diseases）信号通路、帕金森疾病（Parkinson disease）信号通路、朊毒体病（prion disease）信号通路等。GO分析结果显示，与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因主要富集在能量代谢、细胞呼吸、氧化磷酸化调节等生物学过程，主要定位于线粒体内膜、线粒体内部的大分子蛋白质复合物等，参与调节跨膜转运活性等分子功能。

2.3 与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因筛选的结果及验证 成功构建一个共有58 个节点、124 条相互作用线的与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因蛋白质的PPI 网络图（见图1）。与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因为：线粒体内膜蛋白基因（Inner membrane protein，IMMT）、动态蛋白1 样蛋白基因（Dynamin 1 Like，DNM1L）、ATP 合酶F1 亚 基α 基 因（ATP Synthase F1 Subunit Alpha，ATP5A1）、 ATP 合酶 F1 亚基β 基因（ATP synthase F1 β subunit，ATP5B）、细 胞 色 素C1 基 因（Cytochrome c-1，CYC1）、 泛醌氧化还原酶核心亚基 S1基因（Ubiquinone oxidoreductase core subunit S1，NDUFS1）、泛醌氧化还原酶亚基A9 基因（Ubiquinone oxidoreductase subunit A9，NDUFA9）、苹果酸脱氢 酶1 基 因（Cytosolic Malate dehydrogenase 1，MDH1）、异柠檬酸脱氢酶3α 基因（Subunit of isocitrate dehydrogenase 3，IDH3A）、泛醌细胞色素c 还原酶复合物核心蛋白1基因（Ubiquinol-cytochromecreductase core protein 1，UQCRC1）。与正常骨骼肌组织相比，肌少症患者骨骼肌组织中IMMT、DNM1L表达降低（P均＜0.05）。

图1 与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因蛋白质的PPI图

3 讨论

我国已进入老龄化社会，老年肌少症不仅严重影响患者生活质量，还成为当今社会的严重的社会问题。肌少症发病机制尚不明确，有研究[3］显示线粒体自噬参与肌少症的发病。线粒体自噬功能紊乱是各种骨骼肌肉疾患的潜在病因之一，通过调节线粒体自噬能维持骨骼肌稳态，但线粒体自噬相关通路在骨骼肌中发病机制中的作用尚有争议[9］。虽然许多研究在细胞或动物模型中显示线粒体自噬对骨骼肌有保护作用，但大型临床试验[10］尚未能证明改善线粒体自噬治疗在肌少症中的效果。肌少症的发病机制非常复杂，单一的机制无法解释其生理病理学改变，因此寻找肌少症患者线粒体自噬的相关生物学标志物，在进一步了解肌少症组的发病机制及寻找治疗方案中意义重大。

本研究采用生物信息学分析方法对GEO 数据库GSE1428 数据集基因表达图谱进行分析，筛选出99 个与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因。GO 富集结果显示这些基因主要参与能量代谢、细胞呼吸、氧化磷酸化能量代谢等过程。KEGG富集分析结果显示，目标蛋白主要参与神经变性途径-多种疾病信号通路、帕金森疾病通路等，上述通路均涉及神经系统变性疾病。肌少症与神经系统变性疾病均为老年人常见疾病，肌少症与帕金森病的发病具有相关性，且相互影响。帕金森病合并肌少症患者较不合并肌少症者更易出现运动量减少、步态减慢、日常生活能力下降，这严重影响此类患者生活质量[11］。肌少症与神经系统变性疾病常伴随发生，提示两种疾病可能存在有共同的发病机制，但尚不明确。有研究[12］显示运动神经元的减少可能参与了两种疾病的共同发病。本研究发现线粒体自噬有可能参与了肌少症与神经变性疾病的共同发病，这为探索两种疾病的共同发病机制提供一定的参考。本研究利用Cytoscape软件对蛋白互作结果进行分析，利用插件 CytoHubba鉴定了10 个与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因。最终经过GSE136344 数据集验证最终确定IMMT、DNM1L可能参与肌少症的发病。

IMMT是是一种关键的跨膜蛋白编码基因，在线粒体功能、蛋白质转运、线粒体DNA 转录、三磷酸腺苷生成和细胞凋亡中起关键作用。IMMT下调、修饰或破坏将导致线粒体功能障碍和细胞死亡。IMMT与肿瘤、糖尿病心肌病、缺血再灌注等疾病的发生发展有关，目前尚无IMMT与肌少症发病有关的相关报道[13-14］。本研究发现IMMT 为肌少症发病的关键基因，这可能是因为IMMT 与线粒体功能障碍有关。DNM1L为GTP 酶动力蛋白超家族的一个成员，主要功能为编码动力蛋白相关蛋白1（Dynamin-related protein 1，Drp1）。Drp1 是鸟苷三磷酸水解酶动力蛋白超家族的成员，能够介导线粒体外膜分裂。此外，DNM1L还在很大程度上参与了线粒体自噬、运动、过氧化物酶体断裂和细胞死亡[15-17］。有研究[18］显示慢性肾功能不全患者常合并肌少症，而慢性肾功能不全患者DNM1L含量明显增高，这证实了DNM1L可能通过调节线粒体自噬参与了慢性肾功能不全患者肌少症的发病。本研究显示IMMT、DNM1L为肌少症发病的关键基因，这可能是因为两种基因均与线粒体功能密切相关，通过影响线粒体稳态参与肌少症发病。

综上所述，与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因共99个，与肌少症发病相关的线粒体自噬差异表达基因可通过影响神经变性途径—多种疾病信号通路、帕金森疾病信号通路、朊毒体病信号通路等，调控能量代谢、细胞呼吸、氧化磷酸化调节等过程，参与调节跨膜转运活性等分子功能。肌少症患者骨骼肌组织中ATP5A1、 ATP5B低表达。ATP5A1、 ATP5B可能为与肌少症发病相关的线粒体自噬靶点基因。