神经肽P物质通过调控表皮干细胞非对称增殖促进小鼠创伤愈合

肖彤,夏育民,肖生祥

［作者单位］西安交通大学第二附属医院皮肤科,陕西 西安 710004

创伤愈合是一系列复杂且有序的过程,主要包括炎症期、生长期和重塑期[1]。表皮的再上皮化是创伤愈合标志,表皮干细胞的参与在其中发挥重要作用[2]。在表皮中,干细胞(stem cell,SC)散在分布于基底层,而定向分化的祖细胞(committed progenitor,CP)分布于基底层和基底上层。

表皮干细胞主要有3种分裂方式:①对称性自我更新(symmetric self-renewal,SSR),即一个干细胞分裂为两个干细胞;②非对称性自我更新(asymmetric self-renewal,ASR),即一个干细胞分裂为一个干细胞和一个分化的角质形成细胞;③对称性分化(symmetric differentiation,SD),即一个干细胞直接分裂分化成为两个角质形成细胞[3]。而定向祖细胞仅可进一步对称性分化为分化程度更高的角质形成细胞(图1b)。针对小鼠尾部皮肤创伤愈合的研究证实,表皮干细胞以非对称分裂为主,稳定持续地为表皮再上皮化提供细胞来源以及促进表皮的复层化[4]。

Sample pictures of wound healing in mice(n=3);Change of wound area;Estimated wound healing time

感觉神经缺失可导致皮肤创伤愈合延迟[5],例如由辣椒素(capsaicin)诱导的感觉缺失可损害创伤中毛囊隆突区干细胞向表皮的迁移和增殖,从而阻碍创伤愈合[6]。辣椒素处理后实验动物神经元出现退行性变,神经肽含量在下丘脑、脊髓、背根神经节及肾脏等组织中显著降低[7-8]。相反,神经肽,如血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和P物质(substance P,SP)等可促进创伤愈合[9-11]。

神经肽在创伤愈合中的作用是否有表皮干细胞的参与及其参与方式仍不甚清楚。本研究通过观察神经肽P物质对小鼠皮肤厚度的影响,对创面愈合速度的影响,以及创面角质形成细胞增殖的方式等以期表明P物质可调控表皮干细胞的增殖方式促进损伤愈合。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 C57/BL6小鼠共36只,SPF级,雄性,6～8周龄,均购于西安交通大学医学部实验动物中心,体重约18～22 g,于该中心饲养处理。将小鼠随机分为4组(9只/组),分别为PBS对照组(Control)、辣椒素处理组(Cap)、P物质处理组(SP)和辣椒素+P物质处理组(Cap+SP);进一步将4组小鼠分为非创伤组(3只/组)和创伤组(6只/组);创伤组又进一步分为拍照观察组(3只/组)和细胞提取组(3只/组)。

1.2主要实验仪器与试剂 荧光显微镜(Leica,DM4);热敏甩尾测痛仪(Panlab,LE7106)。HE染色试剂盒(Solarbio,G1120);角蛋白1抗体(Novus Biologicals,NB100-2756);Numb抗体(Abcam,ab4147);DAPI抗荧光淬灭剂(Invitrogen,S36973);辣椒素(MCE,HY-10448,纯度99.85%);P物质(MCE,HY-P0201,纯度99.42%)。

1.3辣椒素处理小鼠 于创伤处理或取材前3周(75 mg/kg)及取材前2周(50 mg/kg)对实验小鼠局部皮下注射辣椒素[12]。后对辣椒素处理组(包括Cap和Cap+SP组)及非辣椒素处理组(包括对照组和SP组)小鼠进行热敏甩尾测痛鉴定,即鉴定小鼠尾部对热刺激的反应时间,结果显示辣椒素处理组较非辣椒素处理组反应时间显著增长[(7.78±0.24)svs.(2.94±0.17)s,P<0.000 1]。

1.4P物质处理小鼠 于创伤处理或取材前10 d及创伤处理后14 d内,每2 d对实验小鼠进行1次局部皮下注射,每个部位注射P物质10 nmol/kg,溶于PBS缓冲液中[13]。对照组于相同时间节点注射等量PBS。

1.5非创伤组小鼠取材及HE染色 取非创伤组小鼠注射局部皮肤组织置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋切片后,经二甲苯、梯度酒精脱蜡复水后进行苏木素及伊红染色,中性树脂封片。后续进行皮肤厚度及基底层细胞密度测定。

1.6创伤组小鼠取材及处理 于创伤组小鼠背部进行钻孔处理为皮肤全层损伤,直径为6 mm。部分小鼠每3 d进行拍照观察直至创面愈合,后期对创面面积及愈合速度分析处理。其余小鼠于创伤后4 d取创伤周围5 mm范围内皮肤分离提取角质形成细胞,待细胞贴壁后进行细胞免疫荧光染色以分析细胞增殖分裂方式。

1.6.1角质形成细胞分离提取 获得皮肤组织后依次经75%酒精、5×双抗HBSS清洗后,去除多余皮下组织,0.25%中性酶Dispase Ⅱ 4 ℃过夜处理以分离真表皮。次日剥离表皮组织后置于0.05%胰酶/EDTA中消化为单个细胞,以含10% FBS DMEM培养基中和胰酶,经100 μm筛网过滤后收集细胞,于CNT-PR培养基重悬细胞后以20 000细胞/孔种于8室载玻片中。

1.6.2细胞免疫荧光染色 细胞经4%多聚甲醛固定,0.5% Triton裂解缓冲液通透处理后,以角蛋白1抗体(keratin 1,K1)和Numb抗体(1∶1 000)室温孵育1 h,清洗后分别以Alexa Flour 488和568荧光二抗室温避光孵育1 h,最后以DAPI抗荧光淬灭剂封片。实验结果应用Fiji软件处理。

2 结果

2.1P物质促进创伤愈合 对每只小鼠创伤面积(mm2)(图1a)和创伤后时间(d)进行线性回归(图1b),根据创伤初始面积(28.26 mm2)和线性回归斜率可计算得出每组创伤愈合时间,并对4组数据进行统计分析(表1,图1c)。结果表明,与对照组相比,SP组加快创面愈合(P=0.056 1),Cap组则显著减缓创面愈合(P<0.000 1);而与Cap组相比,Cap+SP组中神经肽SP的加入显著逆转这一损伤(P<0.000 1)。结果显示P物质对皮肤创伤愈合具有改善作用。

表1 不同组别小鼠的皮肤创伤愈合相关指标的检测结果

2.2P物质增加表皮干细胞非对称性自我更新 创伤后基底层细胞的增殖主要发生于创伤后第4天,且主要发生于创面周围5 mm范围内[4],因此本研究取相应部位皮肤提取角质形成细胞,以观察创伤后细胞分裂方式。结果以每100个细胞中各类细胞分裂数量呈现(表1,图2a)。结果表明,与对照组相比,SP组表皮干细胞非对称自我更新显著增加(P=0.000 3),Cap组则显著减少表皮干细胞的非对称自我更新(P=0.042 7);而与Cap组相比,Cap+SP 组中P物质的加入可显著逆转此作用(P=0.019)。相反,辣椒素和P物质对表皮干细胞的对称性自我更新没有明显影响(P=0.12)。在细胞对称性分化中,辣椒素和P物质作用趋势和非对称相似(图2b)。因此,P物质主要通过增加表皮干细胞的非对称自我更新以促进创伤愈合。

Note:SSR indicated symmetric self-renewal; ASR indicated asymmetric self-renewal; SD indicated symmetric differentiation.

2.3P物质可增加表皮厚度 对非创伤组的小鼠皮肤进行皮肤厚度测定(表1,图3a)。结果表明,与对照组相比,P物质可显著增加表皮厚度(P<0.000 1),辣椒素诱导的感觉缺失可明显减少表皮厚度(P=0.001 9),小鼠表皮由正常的双层细胞变为单层;而与Cap组相比,Cap+SP组中P物质的加入可帮助感觉缺失的表皮厚度恢复至接近正常(P=0.42)(图3b)。相似的结果也出现在基底层细胞密度中,对每100 μm基底层的细胞数量进行测定,与对照组相比,辣椒素显著减少基底层细胞密度(P<0.000 1),而P物质的加入可帮助恢复基底层细胞密度(P<0.000 1)。在感觉正常的皮肤中P物质并未进一步提高基底层细胞密度(P=0.34)(图3c)。

Histopathological changes in epidermis(HE×100),scale bar=100μm;Comparison of epidermis thickness(n=3); Comparison of basal cell density per 100μm(n=3)

3 讨论

本研究通过神经肽P物质对正常感觉和感觉缺失小鼠皮肤创伤愈合的促进作用,发现其中表皮干细胞通过增加非对称分裂促进细胞增殖,并在促进表皮复层化中发挥重要作用。

表皮干细胞的自我更新及分裂分化主要参与维持皮肤稳态平衡,在皮肤缺损中负责提供细胞来源。干细胞3种分裂方式的平衡在生理状态下至关重要,失衡状态可能导致过度增殖疾病的发生,如银屑病、皮肤肿瘤等。在银屑病中,表皮干细胞以非对称分裂为主,在基底层干细胞数量维持不变的情况下,显著增加表皮的层数[15]。与之类似,干细胞非对称分裂的增加可能参与小鼠炎症性肠病的发生[16]。相反,对称性分裂的显著增加可增加干细胞的数量,并与肿瘤的发生有密切关系[17]。本研究发现,P物质主要通过增加表皮干细胞非对称分裂促进创伤皮肤再上皮化,而对称性分化的增加可能为P物质对表皮干细胞的直接促进作用,也可能由于非对称分裂后定向祖细胞数量增加,而导致定向祖细胞的对称性分化增加;或二者同时存在。角蛋白1(keratin 1,K1)是一种角质形成细胞分化的标记,而Numb作为一种Notch抑制剂,被认为是细胞非对称分裂的标记[14]。对称性自我更新2个分裂细胞均不表达K1和Numb;对称性分化2个分裂细胞均表达K1和Numb;而非对称性自我更新后2个子细胞中仅有1个表达K1和Numb。据此,本实验对创伤后细胞分裂的方式进行统计分析。本研究中由于K1/Numb标记无法区分对称性分化的母细胞来源,因此无法对此现象做出准确判断。由于非对称性分裂的增加,小鼠表皮分层增加,表皮厚度有明显改变。而基底层细胞数量达到饱和后,细胞可继续向棘层迁移分化。

临床中常见糖尿病患者创伤愈合延迟,主要与周围神经受损缺失、微血管功能受损、感染和免疫异常有关。严重者可见糖尿病溃疡、糖尿病足并有截肢致残可能[18]。神经肽在创伤愈合过程中作用机制复杂,可能与其调节炎症因子如白介素6、白介素8、肿瘤坏死因子α等有关。P物质作为神经肽的重要成员,可能通过调节创伤初期炎症反应、促进巨噬细胞型别转换等促进创伤愈合[19-20]。本研究进一步证明,P物质对创伤愈合的促进作用除对炎症期的调节之外,其对细胞增生期尤其是对表皮干细胞的非对称分裂方式有明显促进作用,从而促进表皮的再上皮化,加速创伤愈合。

综上,本研究通过对神经肽P物质对表皮干细胞分裂方式的调节作用发现,P物质可通过增加表皮干细胞的非对称分裂促进表皮再上皮化,进一步为P物质在创伤愈合细胞增生期的调节作用提供理论基础。