化学发光法弱阳性质控品的制备及应用评价

肖杰 陈亚琴 韩小玲

加强传染病防治一直是国家卫生领域的工作重点。国家卫生健康委员会制定了预防艾滋病、梅毒和肝炎母婴传播的工作规范，其中传染性指标的筛查是核心内容之一[1]。传染性4 项包括乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、丙型肝炎抗体（hepatitis C antibody，HCV-Ab）、梅毒螺旋体特异性抗体（treponema pallidum specific antibody，TP-Ab）、人类免疫缺陷病毒抗原抗体（human immunodeficiency virus antigen antibody，HIV-Ag/Ab），成为手术前监测患者感染状态必须检查的指标。目前临床上常用的免疫学检测方法有胶体金法、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及化学发光法，化学发光法通过全自动化学发光免疫分析仪对抗原抗体反应后发光强度进行测定，以确定待测物含量，具有操作简便、敏感度高、特异性强等优势，已普遍应用于临床医疗机构[2-4]。为保证检验结果的准确性，临床实验室需开展室内质量控制（简称质控），《医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性检验领域的应用说明》[5]明确指出，宜选择水平为临界值2～4 倍的弱阳性质控物对检测结果进行日常监测，但我国很多医院使用的化学发光免疫分析仪均为进口品牌，其配套的弱阳性质控品也采用进口的质控血清，价格昂贵，大大增加了检验科的使用成本[6]。目前国内替代产品少见，也缺乏自制传染病弱阳性质控品的相关研究。因此，本研究结合实际工作，利用稀释后的阳性患者血清标本自制弱阳性质控品，应用于全自动化学发光免疫分析仪的室内质控过程中，取得了较理想的效果，制备方法、应用情况及均一性、稳定性评估报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

阳性血清和阴性血清均来自2023 年1—2 月武汉大学附属爱尔眼科医院检验科日常检测标本，患者清晨空腹采血5 mL，收集到无添加剂的真空采血管中2 h内送至实验室，以3 000 r/min 的速度离心15 min，分离血清待测。纳入标准：（1）阳性样本HBsAg 浓度2～10 IU/mL，HCV-Ab、TPAb、HIV-Ag/Ab 的样本发光值/标准发光值（S/CO）均在5～20。（2）阴性样本上层血清外观清澈、无纤维蛋白絮状附着。排除标准：（1）来自妊娠、肿瘤、自身免疫性疾病患者的样本。（2）血清有明显脂肪血、溶血、黄疸。本研究经武汉大学附属爱尔眼科医院医学伦理委员会审核批准（伦理审批编号：2023IRBKY0801）。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂

仪器采用美国雅培公司生产的I2000SR 全自动化学发光免疫分析仪，试剂、校准品及耗材等均为原厂进口配套产品；美国雅培CONTROL+1 原装质控品，批号为32053FN01，按说明书要求存放至2～8 ℃冰箱冷藏保存；一次性采血管为美国BD 公司（Becton,Dickinson and Company）生产。

1.2.2 弱阳性质控品的制备

根据中国合格评定国家认可委员会《实验室内部研制质量控制样品的指南》[7]文件要求，分别收集传染性4项阳性血清（无明显溶血、黄疸、脂肪血和污染）5 mL装于4 支无菌试管中，56 ℃加热30 min 灭活[8]，用阴性患者血清倍比稀释，直到各项测定值在临界值3 倍左右（HBsAg、HCV-Ab、TP-Ab、HIV-Ag/Ab 临界值分别为0.05 IU/mL、1 S/CO、1 S/CO、1 S/CO），在稀释后的各项血清中加入5 g/L 叠氮化钠防腐，高速离心去除纤维沉淀物，再分别转移至50 mL 的洁净试管中，用冻存管将以上不同项目的弱阳性质控品按每天用量分装、封口、标记，-20 ℃冰箱冷冻保存备用。剩余血清严格按照生物危险品进行废弃处理，操作过程中人员均需做好防护措施，阳性血清稀释、分装均在生物安全柜内进行操作，以防止传染性样本对人员和环境造成污染。

1.2.3 自制弱阳性质控均一性评价

质控品完成配制后，对其进行均一性评价，依据《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[9]的方案，在仪器经过全面保养、各项目重新定标、室内质控在控的情况下，对一批4 项指标弱阳性质控品分别抽查20 支，随机分为2 组（第1 组、第2 组），按患者标本检测程序同时进行检测。比较2 组检测HCV-Ab、TP-Ab、HIV-Ag/Ab 的S/CO 值，HBsAg 的IU/mL 值，差异无统计学意义则均一性评价通过[10]。

1.2.4 自制质控品与原装进口质控品比较

每日取各指标自制弱阳性质控品1 支，在室温复溶后，随日常标本一同上机检测，并用相应的原装雅培CONTROL+1 质控品进行平行检测30 d，计算2 种质控品的均值（x-）、标准差（SD），比较两种质控品检测结果的一致性。

1.2.5 复溶后4 ℃稳定性观察

将-20 ℃保存的自制质控品室温复溶后，每天测定1 次后于4～8 ℃保存，连续检测20 d，计算出、SD 和变异系数（CV），根据WS/T 494—2017《临床定性免疫检验重要常规项目分析质量要求》[11]对批间精密度的要求，批间CV 应＜15%，以此判断复溶后4 ℃稳定性是否良好。

1.2.6 长期稳定性观察

在-20 ℃冻存条件下，连续测定4 项自制弱阳性质控品4 个月，计算测定结果每个月x-、SD，观察自制质控品的稳定性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 27.0 软件对数据进行分析，计量资料以（）表示，2 组间比较采用两独立样本均数t检验，多组比较采用方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自制弱阳性质控品均一性评价

HBsAg、HCV-Ab、TP-Ab、HIV-Ag/Ab 弱阳性质控品2 组间检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05），均一性评价通过。见表1。

表1 自制弱阳性质控品均一性评价（）

表1 自制弱阳性质控品均一性评价（）

2.2 自制弱阳性质控品与原装雅培质控品30 d 检测值比较

每日取出自制弱阳性质控品融化后，观察其外观清澈透明，未见浑浊及沉淀现象。自制弱阳性质控品各项目的30 d 测定结果与原装质控品基本一致，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 自制弱阳性质控品与原装雅培质控品30 d 检测值比较（）

表2 自制弱阳性质控品与原装雅培质控品30 d 检测值比较（）

2.3 4 项自制弱阳性质控品复溶后4 ℃放置20 d 稳定性

将复溶后的自制弱阳性质控品存放至4 ℃冰箱，连续测定20 d，各指标质控品的CV 均＜15%。见表3。

表3 4 项自制弱阳性质控品复溶后4 ℃放置20 d 稳定性

2.4 自制弱阳性质控品4 个月稳定性

-20 ℃保存条件下，连续测定4 个月，自制弱阳性质控品每个月结果间的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 自制弱阳性质控品4 个月稳定性（）

表4 自制弱阳性质控品4 个月稳定性（）

注：与1 个月比较，①P ＞0.05；与2 个月比较，②P ＞0.05；与3 个月比较，③P ＞0.05。

3 讨论

室内质控是按照一定的策略对稳定样本进行测定，并对测定结果进行统计学分析，其结果反映了检测仪器或方法的检测性能，并且能够对同批检测结果的可靠性进行评价，错误的分析结果会给患者及临床诊疗造成负面影响[12]。在室内质量控制过程中重复检测的稳定样本称为质控品，检测的目的在于监控分析的全程，并且能够在可能产生有误结果时向检测者提出警告。化学发光免疫分析是特定的抗体或抗原与信号发生物质结合，在光化学反应作用下产生化学发光现象，发射出强光，利用光学仪器测量其强度，从而确定样品中被检测分子的浓度，具有敏感度高、特异性好、测试时间短、自动化程度高等特点，在临床传染病检测中应用广泛[13]。良好的质控品能够有效监测系统产生的误差，尤其是在临界值左右的弱阳性质控品对监控整个测定过程具有重要意义[14]。但由于原装配套质控品均需要进口，价格昂贵，很多基层医院难以承受其经济成本，给室内质量控制工作造成影响。因此，实验室自制弱阳性质控品已经开始在国内医院应用[15-16]。

《医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性检验领域的应用说明》[5]对自制质控物的评价要求至少包括均一性评价及稳定性评价，本实验参考了《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[9]的方案，结果显示质控品的均匀性良好。自制弱阳性质控品与原装雅培质控品30 d 检测值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明自制弱阳性质控品可以替代原装质控品用于日常检测数据的监测。将复溶后的自制弱阳性质控品存放至4 ℃冰箱，连续测定20 d，各指标质控品的CV均＜15%，表明稳定性良好，提示自配弱阳性质控品在4 ℃下至少可稳定20 d。质控品在-20 ℃冷冻保存，连续观察4 个月，各月检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示自制弱阳性质控品在-20 ℃条件下保存能有效稳定4 个月。有研究表明，自制质控品在-80 ℃下保存能稳定至少6 个月[17-18]。但许多基层医院并没有这样的冷藏条件，相比之下，-20 ℃保存更加可行，并且便于管理和操作。

自制质控品除具有无基质效应、制作过程简单、成本低廉外，还具有一定的可塑性，可以根据具体的临床分析需求来进行不同浓度的配制，以实现更加精准的质控[19]。通过验证并确定自制质控品的稳定时间，发现在其稳定期内进行室内质控完全可行，这为价格昂贵的商品化质控物提供了一种可行的替代方案，同时可节省实验室成本。此外，制备弱阳性质控品的过程中，应严格按照生物安全的相关要求做好人员防护措施，收集的传染病阳性标本在操作前应56 ℃加热30 min灭活，整个制备过程必须在生物安全柜内进行，以防人员发生感染。

综上所述，本院自制传染性弱阳性质控品均匀性、稳定性良好，-20 ℃条件保存时，至少可稳定4 个月，在其稳定期内能替代进口质控品用于室内质量控制。