金枪鱼亚微米-纳米级鱼骨粉的制备及其对鱼糜凝胶品质的影响

刘晗慧 李增蔚 李 奕 吴 杰 闻 慧 吴劲宇邓尚贵 袁鹏翔，

（1浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316000；2舟山技师学院，浙江 舟山 316000）

金枪鱼在我国远洋渔业中占据重要地位，2022 年金枪鱼捕捞量达34.55 吨［1］。鱼骨占鱼体总质量的20%～30%，其钙化物（57.2%）含量丰富、生物利用度高，是低价生物钙素的潜在来源［2］。但在生产过程中，鱼骨多被加工成低值动物饲料或直接丢弃，造成水产资源的浪费［3］。鱼骨成粉可显著提高鱼骨的食用及经济价值，鱼骨粉中的钙离子和磷酸基团的释放度、流动性、溶解度和持水能力等会随其粒径减少而增强［4］。然而，鱼骨中钙、磷酸基团与胶原纤维构成的牢固网络结构很难使其被超细粉碎。研究者常使用球磨法［5］制备高纯度的纳米级鱼骨粉，利用气流粉碎法［6］和胶体磨法［7］等制备微米级或亚微米级等超微鱼骨粉，但均存在耗时长、能耗大、生产效率低等问题［8］。

挤压膨化技术是集混合、搅拌、破碎、膨化及成型为一体的技术，具有多功能、高产量、高品质等特点［9］。坚硬原料如鱼骨在挤压膨化过程中，常添加淀粉作为关键膨化辅助剂以调节原料膨化程度［10］。Ali 等［11］研究发现，玉米淀粉在130 ℃下经挤压膨化后可高效制备改性玉米淀粉产物。Philipp 等［12］将豌豆蛋白添加至大米淀粉中，在温度130 ℃、转速400 r·min-1条件下，可高效且低能耗制备得到高膨化度且疏松多孔的产物。由此可见，以淀粉作为辅助剂的挤压膨化方法为超细金枪鱼骨粉的高效制备提供了有效手段。

鱼骨粉因其钙离子、磷酸基团释放度高而有望代替传统无机盐成为功能性鱼糜凝胶增强剂［13］。鱼糜的凝胶特性主要取决于盐溶性蛋白在凝胶过程的胶凝情况，目前常用NaCl 和CaCl2等无机盐中的Na+和Ca2+等金属离子促进鱼糜蛋白质中离子交换、增强蛋白质分子之间的凝聚，以及加强蛋白质之间水和能力的稳定性［14］。而超细鱼骨在释放大量Ca2+的同时，还可能释放、暴露出与鱼糜肌动蛋白结合的其他基团或基团末端，以进一步促进凝胶的形成［15］。此外，鱼骨粉还富含磷和胶原蛋白等营养成分，可增加鱼糜的营养及保健价值。

本研究以金枪鱼骨为原料，利用挤压膨化法制备超微鱼骨粉，并与未经挤压膨化粉碎鱼骨粉的物化性质进行比较，明确挤压膨化技术制备超微鱼骨粉的效果。通过与NaCl、CaCl2、大米+淀粉、未经挤压膨化鱼骨粉等对鱼糜凝胶效果的对比研究，明确挤压膨化超微鱼骨粉对鱼糜凝胶品质及蛋白结构的影响，旨在实现金枪鱼鱼骨副产物的高值化开发与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金枪鱼骨、冷冻带鱼鱼糜，浙江省兴业集团有限公司；大米、淀粉、食盐、肠衣（直径25 mm）均为市售；其他化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司（上海）。

1.2 仪器与设备

单螺杆挤压膨化机，永城市圣辉机械设备有限公司；Zetasize Nano ZS90 激光粒度分布仪，英国Malvern公司；Tensor Ⅱ傅里叶红外光谱仪，德国Bruker 公司；S35-LA993 斩拌机，济南九阳股份有限公司；CS-210精密色差仪，杭州彩谱科技有限公司；iTexture 结构测试仪，浙江浙科仪器设备有限公司；Thermo He 型高速冷冻离心机，上海赛默飞世尔科技有限公司；PQ001低场核磁分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；U-2800紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；HR-20旋转流变仪，美国TA仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基于挤压膨化技术制备亚微米-纳米级鱼骨粉 将鱼骨切成约5 cm 小段后于沸水中煮20 min，自来水冲洗干净后70 ℃烘干，并利用粉碎机初步粉碎鱼骨。初步粉碎的鱼骨（40.00%）与大米（52.50%）、淀粉（7.50%）混合均匀后用单螺杆膨化机在130 ℃、转速400 r·min-1条件下处理［16］，所得产物用粉碎机再次粉碎制得挤压膨化鱼骨粉（extruded expanded fish bone meal，EE-FB）；另取与上述步骤中等比例的鱼骨粉（40.00%）与大米（52.50%）、淀粉（7.50%），大米与淀粉先用单螺杆挤压膨化机同条件下处理，再与初步粉碎的鱼骨混合均匀后利用粉碎机进行粉碎，得到未经挤压膨化鱼骨粉（non-extruded expanded fish bone meal，N-FB）。对比研究EE-FB 和N-FB，确定挤压膨化制备亚微米-纳米鱼骨粉的方法。

1.3.2 亚微米-纳米级鱼骨粉物化特性测定

1.3.2.1 鱼骨粉的粒径测定 采用激光粒度分布仪测定鱼骨粉粒度，对比研究EE-FB 组和N-FB 组粒径大小。即以纯水为分散介质，以2%（NaPO3）6为分散剂，超声15 min 使样品分散均匀。利用Zetasizer Software Version 7.13 软件分析结果。鱼骨粉的粒径采用平均直径和粒径分布表示。

1.3.2.2 鱼骨粉的傅里叶红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）测定 利用FT-IR光谱仪对比分析EE-FB 和N-FB 两组鱼骨粉的化学结构。将约1 mg鱼骨粉与溴化钾（KBr） （1∶100，w/w）混合，手动压成半透明薄片，以空白KBr 为扫描背景，FT-IR 扫描范围为400～4 000 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描64次。

1.3.2.3 鱼骨粉的化学组成测定 对比研究EE-FB和N-FB两组鱼骨粉的主要化学组分。参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》［17］中的直接干燥法测定样品水分；参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》［18］中的凯氏定氮法测定样品粗蛋白质含量；参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》［19］中的索氏抽提法测定样品脂肪含量；参照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》［20］中的总灰分测定法测定样品灰分含量；参照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》［21］测定样品钙含量。

1.3.3 挤压膨化亚微米-纳米级鱼骨粉对鱼糜凝胶品质的影响研究

1.3.3.1 鱼糜凝胶的制备 将冷冻带鱼鱼糜在4 ℃下过夜解冻，切碎并斩拌2 min，添加2.5%NaCl 盐擂2 min，分为5 组。其中，1 组不添加任何物质（NaCl组），其他4组分别加入1.125%大米+淀粉（大米+淀粉组）、0.75%的N-FB（N-FB 组）、0.2%的CaCl2（CaCl2组）及0.75%的EE-FB（EE-FB组）（经试验测得0.75%EE-FB 对鱼糜凝胶品质影响效果最好；0.75% N-FB和0.75% EE-FB均以鱼骨粉质量计；0.2%的CaCl2和鱼骨粉钙含量相当）［22］。5 组都加入一定量的冰水，调节水分含量为78%，斩拌3 min，制作温度控制在10 ℃以下。鱼糜灌肠成型后，采用二段加热法（40 ℃-30 min；90 ℃ -20 min）凝胶化，冰水冷却后4 ℃贮藏。对比研究EE-FB对鱼糜凝胶性能的影响。

1.3.3.2 鱼糜凝胶色差测定 将待测样品切成20 mm厚的圆柱体，于室温下平衡30 min。利用色差仪分别测定NaCl 组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB组鱼糜凝胶的L*（亮度）、a*（红/绿色）、b*（黄/蓝色）值。按公式（1）计算白度（W）值：

1.3.3.3 鱼骨凝胶质构特性测定 将待测样品切成20 mm×20 mm 圆柱体。采用P/0.5 S 球形探头测定NaCl 组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜凝胶的凝胶强度，测试前、中、后速度分别为1.0、1.0、10.0 mm·s-1，触发力5.0 g，形变50%，测定并记录断裂力（g）和形变量（mm）。鱼糜的凝胶强度表示为公式（2）：

采用直径为35 mm（P/35）的圆柱形铝制探头对凝胶圆柱体进行两次循环压缩测试，测试前、中、后速度分别为1.0、1.0、10.0 mm·s-1，触发力为5.0 g，形变量为50%，下压高度为10.0 mm，测定并分析样品的硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性［23］。

1.3.3.4 鱼凝胶持水力和蒸煮损失率测定 分别准确称取NaCl组、大米+淀粉组、N-FB组、CaCl2组、EE-FB组鱼糜凝胶样品3.0 g（w1），3层滤纸包裹后，于50 mL离心管中4 ℃和5 000×g离心15 min，再次称重（w2）。按公式（3）计算持水力（water holding capacity，WHC）：

将切成薄片的各组鱼糜样品称重（m1）后放入封口蒸煮袋，90 ℃恒温水浴20 min，迅速取出鱼糜凝胶，轻柔擦去表面液体后再次称重（m2）。按公式（4）计算蒸煮损失率：

1.3.3.5 鱼糜凝胶低场核磁共振测定 分别取NaCl组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组各组鱼糜凝胶样品置于高2.5 cm 的核磁管中，采用核磁共振分析仪测定横向弛豫时间常数T2，根据T2图谱中各峰面积计算不同类型水分含量的比例。

1.3.4 挤压膨化亚微米-纳米级鱼骨粉对鱼糜凝胶蛋白质结构的影响

1.3.4.1 鱼糜糊的流变特性测定 利用流变仪测定NaCl 组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜糊的储能模量（G′）和损耗模量（G″）。即将鱼糜糊均匀涂抹在测试平台，用硅油密封，采用温度扫描模式测定，测定参数为振荡频率1 Hz、应变2%、平行板间距1 mm，升温扫描范围20～90 ℃、升温速率4 ℃·min-1［24］。

1.3.4.2 鱼糜凝胶的化学作用力测定 准确称取NaCl 组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜凝胶样品3.0 g，分别与10 mL不同的SA （0.05 mol·L-1NaCl）、SB （0.6 mol·L-1NaCl）、SC （0.6 mol·L-1NaCl+1.5 mol·L-1尿素）、SD （0.6 mol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素）、SE （0.6 mol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素+0.05 mol·L-1β-巯基乙醇）等化学作用力破坏试剂混合均质，4 ℃搅拌1 h 后离心，测定上清液中的蛋白浓度［25］。化学作用力以组间上清液蛋白浓度差表示：离子键为SB 与SA 差，氢键为SC 与SB 差，疏水作用力为SD 与SC 差，二硫键为SE与SD差。

1.3.4.3 鱼糜凝胶的FT-IR 测定 将NaCl 组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜凝胶样品冷冻干燥后，取1 mg 干燥后的样品与KBr 混合研磨后压片。FT-IR 吸收光谱范围为400～4 000 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描64 次。对所得图谱中酰胺Ⅰ带进行去卷积、二阶求导，并通过高斯曲线拟合得到蛋白质二级结构的相对含量变化。

1.3.4.4 鱼糜凝胶的扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察 将制备好的NaCl 组、大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜凝胶样品用刀片切成1 mm 厚度的小片，采用戊二醛溶液固定，用磷酸盐缓冲液洗涤，依次进行乙醇脱水、叔丁醇置换、冷冻干燥和喷金处理，在加速电压3 kV 下放大10 000 倍观察鱼糜凝胶的微观结构。

1.4 数据分析

所有试验均重复3 次，每次样品检测重复3 次以上。用SPSS 16.0 软件对数据进行分析，显著性差异检验使用Duncan 多重检验，差异显著为P＜0.05。用Origin 8.6软件制图，结果以±s的形式表示。

2 结果与分析

2.1 挤压膨化鱼骨粉的物化特性

EE-FB 和N-FB 见图1-A，EE-FB 较N-FB 的颜色更深，粒径结果如图1-B 和图1-C 所示。结果表明，N-FB 的平均粒径为465.03 nm，其中仅有10.80%小于100 nm（纳米级），且17.24%的鱼骨粉粒径高于1 000 nm（微米级，有沙砾感）。而EE-FB 组平均粒径达308.07 nm，显著小于N-FB 组（P＜0.05），且约有59.41%的鱼骨粉粒径属于亚微米级（100～1 000 nm），约有40.59%的鱼骨粉粒属于纳米级（1～100 nm）。由此可见，挤压膨化可显著减少鱼骨粉的粒径，可高效地制备亚微米-纳米级鱼骨粉。图1-D 是N-FB 组和EE-FB组的FT-IR结果，两者图谱基本相同，都暴露出较多的羟基、磷酸基团，由此可知，高温高压的挤压膨化过程并没有破坏鱼骨原有的基团和结构。N-FB 组和EE-FB 组的水分、粗蛋白、脂肪、灰分和钙元素含量测定结果见表1。EE-FB 组的各组分含量均显著低于N-FB 组（P＜0.05），但两组的灰分含量均为最高，粗蛋白含量次之。灰分的主要成分为羟基磷灰石，其含有丰富的钙、磷等矿物元素［26］，且EE-FB 组钙含量达灰分总量的40.00%，高于N-FB 组的37.06%。由此可见，挤压膨化可高效制得亚微米-纳米级鱼骨粉，其粒径更细小且为钙源丰富的蛋白原料，更适于高值化产品的开发。

表1 鱼骨粉基本成分及含量Table 1 Basic composition and content of fish bone meal/%

图1 挤压膨化鱼骨粉（EE-FB）与未挤压膨化鱼骨粉（N-FB）的物化性质Fig.1 Physical and chemical properties of extruded expanded fish bone meal（EE-FB） and non-extruded expanded fish bone meal （N-FB）

2.2 挤压膨化亚微米-纳米级鱼骨粉对鱼糜凝胶品质的影响

2.2.1 鱼糜凝胶色差 色差能反映鱼糜凝胶内部结构的变化，同时也是评价鱼糜凝胶色泽和品质的重要指标之一，其变化与蛋白质成分、变性、聚合、交联程度及表面的光学特性密切相关［27］。NaCl 是鱼糜加工过程中常用的凝胶增强剂。由表2 可知，与NaCl 组鱼糜凝胶相比，CaCl2组鱼糜凝胶的L*无显著差异，b*值显著减小，W显著增加；大米+淀粉组鱼糜凝胶的L*、a*、b*、W均无显著差异；而N-FB 组和EE-FB 组鱼糜凝胶的L*和W均显著减小，b*显著增加，相比之下，0.75%EEFB鱼糜凝胶组的色差变化更大（图2）。

表2 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB对鱼糜凝胶色度和白度的影响Table 2 Effects of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on color and whiteness of surimi gel

图2 添加不同凝胶物的鱼糜凝胶图Fig.2 Diagrams of surimi with the addition of different gels

2.2.2 鱼糜质构特性 破断力和破断距离是影响鱼糜凝胶质构特性的关键参数，两者均与凝胶强度呈正相关［23］。由表3可知，EE-FB组鱼糜凝胶的破断力和破断距离最大，其凝胶强度也最强（1 249.65 g·mm），且显著高于其他组。相比NaCl鱼糜凝胶组，EE-FB 组鱼糜凝胶的硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性都显著升高；大米+淀粉组鱼糜凝胶的弹性和咀嚼性无显著变化，而硬度和胶黏性显著降低；添加N-FB 虽能显著增强鱼糜凝胶的强度、硬度和胶黏性，但无法增强其弹性；添加CaCl2虽可显著增加鱼糜凝胶的强度、弹性和咀嚼性，但无法改善其硬度和胶黏性。综合分析，EE-FB 提高鱼糜的质构特性的作用最佳。

表3 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB对鱼糜凝胶质构的影响Table 3 Effects of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on texture of surimi gel

2.2.3 鱼糜凝胶持水力、蒸煮损失率和水分状态 不同处理组鱼糜凝胶持水力和蒸煮损失率结果如图3-A所示，EE-FB 组鱼糜凝胶的持水力显著高于其他组，而蒸煮损失显著低于其他组；CaCl2组的鱼糜凝胶持水力显著低于其他组，而蒸煮损失显著高于其他组；NFB 组、NaCl 组和大米+淀粉组的鱼糜凝胶持水力和蒸煮损失率均维持在中间水平。因此，EE-FB 可提高鱼糜凝胶及其在热加工过程中的持水能力和凝胶网络结构的强度。图3-B为不同处理鱼糜凝胶组的低场核磁共振结果，图中每个峰的面积与鱼糜凝胶不同状态的水分体系密切相关，可精确计算出结合水、不易流动水和自由水的含量。鱼糜凝胶中的结合水能使鱼糜凝胶维持稳定的结构，计算结果表明，大米+淀粉组、N-EB组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜凝胶中的结合水含量相比NaCl 组分别增加了1.06、3.08、0.39、1.72 个百分点，即EE-FB 可最大程度增强凝胶网络与水分子之间的作用力，促进鱼糜凝胶中自由水向更稳定的结合水转化。这与持水性及蒸煮损失率的结果一致，辅证了EE-FB可有效改善鱼糜凝胶的持水性。

图3 不同处理组鱼糜凝胶持水力和蒸煮损失率结果Fig.3 The results of water holding capacity and steaming loss of surimi gel in different groups

2.3 挤压膨化亚微米-纳米级鱼骨粉对鱼糜凝胶蛋白质结构的影响

2.3.1 鱼糜糊蛋白流变特性 流变特性可反映鱼糜蛋白的非破断凝胶特性，其中，常用储能模量（G′）反映样品的弹性趋势，损耗模量（G″）表示样品的粘性趋势［24］。NaCl组、大米+淀粉组、N-FB组、CaCl2组、EE-FB组鱼糜糊蛋白的G′和G″变化趋势分别见图4-A 和图4-B。各组鱼糜糊的G′始终大于G″，表明其具有较高的弹性。温度从20 ℃升至90 ℃的过程中，NaCl 组、大米+淀粉组、CaCl2组鱼糜表现出相似的流变特性，即G′值均在55～60 ℃达到最低点，之后缓慢上升，并在80 ℃后基本保持不变。相比之下，N-FB 组和EE-FB组鱼糜糊均在43 ℃左右到达最低点，随后急剧上升，分别在55 和80 ℃达到最大G′值，其中EE-FB 组鱼糜糊的最大G′值可达11 136.5 Pa，远高于其他组。同时，不同处理组的G″变化趋势和G′相似，在79 ℃后，EE-FB 组鱼糜糊蛋白的G″值最大且远高于其他组。鱼糜糊蛋白流变特性结果表明，EE-FB 组具有最高的蛋白质交联密度，因此能表现出最好的蛋白凝胶弹性（表3），即EE-FB 能最大程度改善鱼糜糊蛋白的流变特性。

图4 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB对鱼糜糊流变特性的影响Fig.4 Effect of NaCl，rice + starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the rheological properties of surimi paste

2.3.2 鱼糜凝胶蛋白的化学作用力 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB 对鱼糜凝胶化学作用力的影响见图5。相比NaCl 组，EE-FB 组鱼糜凝胶的离子键有所下降（下降1.08 g·L-1），但仍维持在较高的水平，而大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组鱼糜凝胶的离子键含量则分别下降了7.24、4.04、2.11 g·L-1。EE-FB 和CaCl2可显著增强鱼糜凝胶的疏水相互作用和二硫键，且EE-FB 的增强效果最显著。相比NaCl 组，N-FB 组鱼糜凝胶的二硫键含量无显著变化且疏水相互作用显著减小，大米+淀粉组鱼糜凝胶的疏水相互作用显著升高而二硫键含量显著减少。离子键主要用来稳定蛋白质之间的聚集，疏水相互作用和二硫键是支撑凝胶结构的主要作用力，因此，EE-FB 可最大程度优化鱼糜凝胶蛋白的结构并促进其凝胶网络的形成。

图5 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB对鱼糜凝胶化学作用力的影响Fig.5 Effect of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the chemical force of surimi gels

图6 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB对鱼糜凝胶二级结构的影响Fig.6 Effect of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the protein secondary structure of surimi gel

2.3.3 鱼糜凝胶蛋白的二级结构 蛋白质的二级结构主要包括β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和β-转角等结构，高含量的β-折叠和低含量α-螺旋能维持鱼糜较好的凝胶特性［28］。相比NaCl 组鱼糜凝胶，大米+淀粉组、N-FB 组、CaCl2组、EE-FB 组鱼糜凝胶的β-折叠含量分别显著增加了0.49、0.30、2.06、2.34个百分点；且EE-FB 组的α-螺旋含量显著减少。由此可见，EEFB 可最大程度增加β-折叠和降低α-螺旋的作用，进而增强鱼糜凝胶强度。

2.3.4 鱼糜凝胶蛋白的SEM NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2、EE-FB 对鱼糜凝胶微观结构的影响见图7，其中NaCl 组鱼糜的微观结构呈现多孔且不均匀（图7-A），N-FB（图7-C）、CaCl2（图7-D）、EE-FB（图7-E）促使鱼糜形成了致密的凝胶网络结构。且EE-FB组（图7-E）鱼糜凝胶的网络结构较N-FB 组（图7-C）、CaCl2组（图7-D）更为致密，这与上述鱼糜凝胶强度（表3）和持水力（图3-A）结果一致。

图7 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB的鱼糜凝胶SEM图Fig.7 SEM image of surimi gels NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB

3 讨论

本研究结果表明，挤压膨化可使高度有序的金枪鱼骨短时间内制备出细小、均匀的亚微米-纳米级鱼骨粉。小粒径的鱼骨粉可暴露出更多的钙离子、磷酸、多肽等末端或基团以表现出更好的理化特性［4］。通过对比发现，挤压膨化技术可改变鱼骨在加工过程中的物理形态，不会改变其基本成分和化学结构，但EE-FB组的各组分含量相比N-FB 组均显著降低。Gao 等［29］研究表明，挤压膨化过程中的高温会加速原料中水分蒸发、诱使部分蛋白质和脂肪变性，同时在挤压膨化设备中会粘黏或残留少量的鱼骨粉，这些因素共同导致EE-FB 组各组分含量降低。Yin 等［5］利用湿法球磨法耗时6 h 得到纳米鱼骨粉。本研究通过挤压膨化技术在1 min 内可制得平均粒径为308.07 nm 的亚微米-纳米级鱼骨粉，虽然粒径达不到湿法球磨法的大小，但可更节能、高效地生产亚微米-纳米级鱼骨粉，更适合工业化生产。

对比探究EE-FB 对鱼糜凝胶品质的影响表明，添加大米和淀粉不会影响鱼糜凝胶色泽，但添加N-FB和EE-FB（两者都含有大米和淀粉）组的L*和W较NaCl组均显著降低，b*均显著增加，这表明鱼骨粉是影响鱼糜凝胶色泽的主要原因。而研究显示，N-FB 和EE-FB 均为淡黄色，且EE-FB 的黄色更深，其鱼糜凝胶b*值也更大，原因可能是未彻底脱去的脂类及蛋白质在高温挤压膨化过程中氧化褐变［30］。因此，EE-FB作为鱼糜凝胶增强剂时，需调控鱼骨粉的添加量以优化鱼糜凝胶色泽。EE-FB 组鱼糜凝胶强度最大且硬度、弹性及胶黏性均较NaCl 组有显著提升，翟璐等［22］关于金枪鱼纳米鱼骨钙对鱼糜凝胶特性影响研究中也有类似结果。EE-FB 较N-FB 粒径更小，可释放更多Ca2+以激活鱼糜内源性转谷氨酰胺酶，使谷氨酸和赖氨酸残基共价交联形成致密蛋白网络结构，从而增大弹性、胶黏性和咀嚼性［31］。同时，EE-FB 高达11.96%的蛋白也能赋予鱼糜凝胶较高的弹性、胶黏性和咀嚼性。鱼骨粉尤其EE-FB 可释放大量的磷酸基团或末端，其可与相邻多肽链的NH3+反应，使蛋白质发生交联，从而增强其凝胶强度和硬度［32］。CaCl2释放的大量Ca2+也可显著增强鱼糜凝胶的弹性和咀嚼性，但其无法释放与NH3+高效作用的基团，因此CaCl2组的凝胶强度和硬度显著低于N-FB 组和EE-FB 组。此外，CaCl2为无机化合物，其可接受程度不及富含蛋白质、脂肪和其他营养成分的天然EE-FB。因此，EE-FB 更适合作为鱼糜凝胶增强剂。

本研究表明，EE-FB 组鱼糜凝胶相比其他组具有最高的持水力和最低的蒸煮损失率，这主要是由于亚微米-纳米级的EE-FB中游离的Ca2+、磷酸基团及暴露的基团或末端诱使鱼糜形成的致密网络结构能捕获更多的水分子并将其保留在凝胶网络中。此外，这些基团或末端还可结合水分子，增强凝胶网络与其之间的作用力［33］，促进EE-FB 组鱼糜凝胶中自由水向更稳定的结合水转化，增加其结合水含量，从而提高持水能力，并有效降低在热加工过程中的蒸煮损失率。相比之下，N-FB 颗粒较大，不利于鱼糜凝胶致密网络的形成及水分的锁定；而NaCl 和CaCl2释放的大量游离Cl-可与鱼糜蛋白表面带相反电荷的基团结合，降低了极性氨基酸与水的结合能力［34］。

本研究中EE-FB 组鱼糜糊在79 ℃后的G′和G″值均显著高于其他组，这表明EE-FB 能使鱼糜肌球蛋白重链和肌动球蛋白变性形成热不可逆的凝胶网络，实现蛋白质的高度交联，表现出较好的蛋白凝胶粘弹性［35］。本研究表明，EE-FB 可显著增强鱼糜凝胶的疏水相互作用和二硫键，这主要归因于EE-FB 可与鱼糜凝胶作用使其肌球蛋白展开，暴露出疏水氨基酸并通过疏水相互作用发生聚集，形成凝胶网络，同时暴露更多的巯基并氧化为二硫键，促进鱼糜蛋白交联［36］。由此可见，EE-FB能促进蛋白质的高度交联并使其表现出优良的粘弹性。此外，蛋白质二级结构中β-折叠的稳定性高于α-螺旋，含有高含量β-折叠和低含量α-螺旋的鱼糜凝胶特性更好。本研究显示，EE-FB 可最大程度增加β-折叠和降低α-螺旋的作用，这主要是由于颗粒细小且暴露更多活性基团的EE-FB 可均匀进入鱼糜，增强蛋白质间相互作用并最终改变蛋白构象，进而最大程度增强鱼糜凝胶强度［37］。

4 结论

本研究采用挤压膨化技术可在1 min 内高效细化鱼骨粉的粒径至308.07 nm，有利于实现亚微米-纳米级鱼骨粉的大规模生产。研究表明，EE-FB 可有效改善鱼糜的凝胶特性、流变学特性、持水力，显著增强鱼糜蛋白凝胶形成过程中疏水相互作用和二硫键的交联，同时可显著提高鱼糜凝胶的β-折叠含量并显著降低α-螺旋含量，进而改善鱼糜品质。因此，EE-FB 能最大程度优化鱼糜的蛋白质结构、改善鱼糜糊蛋白的品质特性。