不同成熟期对花椰菜种子活力及相关生理生化指标的影响

朱世杨 刘 庆 钟伟杰 唐 征

（温州科技职业学院/温州市农业科学研究院，浙南作物育种重点实验室，浙江 温州 325006）

种子质量直接关系到品种的增产丰收和种植效益，成熟度是影响种子质量的重要因子，关系种子发芽、幼苗生长、植株长势以及产量品质形成的潜力［1-3］。花椰菜（Brassicaoleraceavar.BotrytisL.）为十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，杂种优势较强，且具有抗癌防癌作用，栽培面积逐年增加［4-7］。根据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）2021 年统计数据，我国花椰菜种植面积约48.4 万公顷，约占全球种植面积的35.1%，位居世界第一。因此，目前市场亟需大量高质量花椰菜种子，而在高质量花椰菜种子生产中，确立最佳的种子收获期尤为重要。

种子质量好坏直接影响种子萌发及幼苗生长［8-9］，种子活力是种子出苗能力及幼苗素质的总称，也是衡量种子质量的重要综合指标［10-12］。前人在不同作物种子成熟度对种子活力影响的研究结论不尽一致。张靓等［9］研究发现，苦荬菜种子发芽率、发芽势随种子成熟逐渐降低。赵永泉等［13］发现，随着种子成熟度增加，黄花苜蓿种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数逐渐提高。刘国梁等［14］发现，随着成熟度提高，玉米F1种子发芽率不断提高，但简化活力指数先增加后降低。李剑等［15］发现，大麦种子发芽指数和活力指数呈先升高后降低的变化趋势。可见不同作物种子活力与其成熟度关系较复杂，明确这两者的关系对确立最佳的种子收获期和指导高质量种子生产极其重要。

种子活力与生物膜的结构密切相关，活力高的种子，膜结构比较完整［16］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）是种子活力的保护酶系统，具有清除活性氧自由基、防止细胞膜过氧化作用［17-19］。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是细胞膜脂过氧化的主要产物，可用来衡量膜脂过氧化程度，间接反应细胞膜的完整性［20-22］。种子浸泡液电导率大小也能反映细胞膜完整性程度，电导率越大表示细胞膜的完整性越差［23］。一般随着种子成熟度增加，种子SOD、POD 活性增强，电导率和MDA 含量降低，细胞膜的结构越趋向稳定，进而保障种子活力和种子质量。

花椰菜种子生产中，如种子采收过早，尚未达到生理成熟，种子活力会受影响；而采收过迟，易发生落粒损失，还延长制种周期，增加管理成本［24］。目前有关花椰菜种子成熟程度对种子活力影响的研究报道尚少。朱世杨等［24］在中晚熟花椰菜品种瓯松90 天制种研究中发现，随着种子成熟度增加，SOD 和POD 活性显著增加，MDA 含量和种子浸泡液电导率显著降低，授粉后55 d 种子已达可采收程度，且对种子发芽和幼苗生长无影响。

瓯松60天［浙认蔬2019003］是温州市农业科学研究院花椰菜课题组（本课题组）最新育成的松花型花椰菜早熟品种，比同生育期台湾品种美青松60 天增产16.1%［25］，应用前景广阔。因此，本试验以瓯松60 天为材料，分析不同种子采收期对种子活力、抗氧化酶活性等的影响，旨在为其杂交制种中明确合理的种子收获期提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验于2019年9月—2020年5月在温州种子种苗科技园（28°05′9.14″N，120°31′14.74″E）育种大棚进行，试验材料为花椰菜瓯松60 天，是利用细胞质雄性不育系育成的松花型早熟品种，由本课题组提供。2019年9月下旬和10月上旬，分别将花椰菜瓯松60天父本和母本定植于8 m×50 m的塑料大棚中，父本∶母本=2∶3；2020年3月13日，选择塑料大棚中间位置母本进行试验，用剪刀修剪母本的健壮花枝，留下生长一致的花朵，然后用父本的新鲜花粉涂抹于母本柱头上进行人工授粉杂交。在授粉后40、45、50、55、60、65 d，分期分批采收角果运至实验室。一部分用于测定种子含水量、鲜种子千粒重和种子浸泡液电导率等指标。同时，另取一部分角果装入尼龙网袋，晾晒至种子水分8%以下，手工脱粒后装入牛皮纸袋中，用于测定种子活力及相关生理生化指标。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 种子物理特性 角果运至实验室后，随机取10 个角果，用游标卡尺测量角果长度和宽度，用千分之一天平称量角果质量。然后手工脱出种子，用HR105 型卤素水分测定仪（杭州汇尔仪器设备有限公司）测定种子含水量，即实测水分。用千分之一天平称量鲜种子千粒重，即实测千粒重。参考《种子检验技术》［26］计算规定水分含量（8%）千粒重，重复3次：

式中，规定水分千粒重和实测千粒重单位为g；规定水分含量和实测水分含量为百分数。

1.2.2 种子发芽指标 准备培养皿（Φ=9 cm）若干，清洗干净晾干，垫两层湿润滤纸作发芽床。随机数取不同成熟期干种子50 粒，播种于培养皿中，盖上培养皿盖子，置于25 ℃培养室（光照∶黑暗=12∶12）培养7 d。3次重复。每天记录发芽种子数，第7天取5株幼苗测量苗高和根长，并计算种子发芽率、发芽势和活力指数［27］：

式中，Gt指第t天发芽种子数，Dt指相应发芽的天数。

1.2.3 种子生理生化指标 电导率（electrical conductivity，EC）测定主要参考樊廷录等［28］的方法，称取鲜种子0.2 g，放入干净小烧杯中，用ddH2O 冲洗5 次，吸水纸吸干表面水分，然后放入ddH2O 冲洗3 次的离心管中，加入ddH2O 20 mL，25 ℃黑暗浸泡24 h后，用DDS-307 型电导仪［上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司］测定种子浸泡溶液的电导率：

电导率（μs·cm-1·g-1）=（ddH2O 浸泡种子24 h 后浸出液电导率-种子刚加入ddH2O 的初始电导率）/种子重量

SOD、POD 活性和MDA 含量测定方法参考《植物生理生化实验原理和技术》［29］，称取干种子0.2 g，用ddH2O 冲洗3 次，置于垫有蒸馏水湿润滤纸的培养皿中，25 ℃萌动24 h后，用镊子转移到-20 ℃预冷过的研钵中，加0.05 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 值7.0）6 mL 研磨成匀浆，15 000 r·min-1条件下4 ℃离心20 min，上清液即为酶粗提取液，用于SOD 活性、POD 活性和MDA含量的测定。

1.3 数据分析

采用Excel 2007 进行数据处理和图、表绘制和回归分析。参考《试验统计方法》［30］进行多重比较和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟期对花椰菜种子物理特性的影响

随着种子采收期推迟，瓯松60天角果，授粉后40、45、50 d 为绿色，55 d 转蜡黄色，60 d 转枯黄，65 d 基本枯黄（图1），易落粒。授粉后40、45、50、55、60、65 d，角果长度和角果宽度在不同发育天数之间无显著差异；角果重和角果含水量总体呈降低趋势，其中角果重在授粉后40、45、50 d 之间无显著差异，而在授粉后55 d则显著降低；角果含水量在授粉后40、45 d之间无显著差异，50 d开始显著降低。说明授粉后55 d，瓯松60天角果大小已基本成型，但角果重和角果含水量仍在下降中。

图1 不同授粉天数后的花椰菜角果和种子Fig.1 The cauliflower pods and seeds after different days of pollination

随着种子发育程度增加，瓯松60 天种皮由淡绿、绿色逐渐转成黄褐色、褐色，种皮由光滑有亮泽逐渐转成微皱无亮泽（图1）。由表1 可知，授粉后40、45、50、55、60、65 d，种子含水量变化范围为36.42%～62.83%，鲜种子千粒重变化范围为6.072～7.146 g，种子含水量和鲜种子千粒重在不同授粉天数之间呈降低变化趋势。鲜种子千粒重折算成规定水分（8%）千粒重分别为2.887、3.610、4.021、4.364、4.294、4.284 g，其中授粉后55、60、65 d之间无显著差异，且均显著高于50 d。说明授粉后55 d，瓯松60 天种子内干物质积累已基本完成，但种子含水量仍在下降。

表1 不同成熟期对花椰菜种子重量及其含水量的影响Table 1 Seed water content and seeds weight of cauliflower under different seed maturity period

2.2 不同成熟期对花椰菜种子活力和幼苗生长的影响

由表2 可知，授粉后40、45、50、55、60、65 d，种子发芽率、发芽势、活力指数、苗高和根长随种子发育天数增加呈先增加后稳定趋势。其中，种子发芽率变化范围为85.33%～100.00%，发芽势变化范围为79.33%～100.00%，授粉后50、55、60、65 d之间这两个种子发芽指标均差异不显著，且均显著高于40、45 d。活力指数变化范围为126.26～201.58，苗高变化范围为3.37～3.62 cm，根长变化范围为6.06～7.91 cm，授粉后55、60、65 d 之间这三个指标差异不明显，且均显著高于50 d。可见，授粉后55 d，瓯松60天种子活力已经达到稳定水平，发芽率为98%，且对幼苗生长没有明显影响，种子已达可采收程度。

表2 不同成熟期对花椰菜种子活力和幼苗生长的影响Table 2 Effects of different maturity period on seed vigor and seedling growth of cauliflower

2.3 不同成熟期对花椰菜种子抗氧化酶活性和细胞膜稳定性的影响

由表3 可知，授粉后40、45、50、55、60、65 d，种子SOD 活性变化范围为64.30～77.11 U·g-1，POD 活性变化范围为35.56～93.89 U·g-1，SOD 活性和POD 活性在授粉后55、60、65 d之间无显著差异，且均显著高于50 d，可见SOD、POD活性随种子发育程度增加呈先增加后稳定趋势。MDA含量变化范围为14.62～62.37 nmol·g-1，种子浸泡液电导率变化范围为36.23～67.35 μs·cm-1·g-1，这两者在授粉后55、60、65 d 之间同样无显著差异，且均显著低于50 d，可见MDA含量和种子浸泡液电导率随种子发育程度增加呈先降低后稳定趋势。综上可知，授粉后55 d，瓯松60天种子清除活性氧自由基防止膜脂过氧化能力和细胞膜结构的完整性已趋于稳定水平。

表3 不同成熟期对花椰菜种子SOD活性、POD活性、MDA含量和电导率的影响Table 3 Effects of different maturity period on SOD and POD activities，MDA content and electric conductivity of cauliflower seeds

2.4 种子重量、种子活力及相关生理生化指标与种子发育天数的相关性

由图2 可以看出，不同发育程度瓯松60 天鲜种子千粒重与种子成熟度呈极显著线性负相关，y鲜种子千粒重=-0.037x+8.553（R2=0.936，P＜0.01），即随种子采收天数推迟，种子重量呈降低变化。杂交种子生产中可根据授粉后天数来预测不同成熟期的种子发育状况。随着授粉后天数增加，种子活力指数呈抛物线变化，最大值在授粉后55～65 d 出现，二项式拟合函数为y活力指数=-0.131x2+16.957x-344.480，达极显著水平（R2=0.970，P＜0.01），利用该函数关系可通过授粉后天数来预测不同成熟期的种子活力情况。

图2 种子重量、种子活力、酶活性、丙二醛含量和电导率与种子成熟期的函数关系Fig.2 The mathematic relationship between seed maturity and seed weight，seed vigor，enzyme activities，MDA content and electric conductivity

随着种子成熟期增加，种子SOD 活性、POD 活性也呈抛物线变化特点，最大值也在授粉后55～65 d 出现，这两个抗氧化酶活性二项式拟合函数为ySOD活性=-0.020x2+2.668x-10.420，yPOD活性=-0.112x2+14.417x-368.610，均达显著水平（P＜0.05）。与SOD、POD 活性变化相反，MDA 含量和种子浸泡液电导率呈“倒钟形”二项式变化特点，最小值在授粉后55～65 d出现，拟合函数为yMDA含量=0.113x2-13.771x+433.780，y电导率=0.088x2-10.319x+338.680，均达极显著水平（P＜0.01）。因此，可用这四组函数来预测种子保护酶清除活性氧自由基防止细胞膜过氧化的能力，进而预测不同成熟期种子细胞膜结构的完整性。

2.5 种子物理特性、酶活性、丙二醛含量、电导率与种子活力的相关性

由图3 可以看出，种子活力与鲜种子千粒重呈显著线性负相关，拟合函数为y=-78.259x鲜种子千粒重+691.860（R2=0.790，P＜0.05），与种子含水量呈极显著线性负相关，拟合函数为y=-3.054x种子含水量+312.860（R2=0.954，P＜0.01），即随着种子发育程度增加，种子重量及其水分含量降低，种子活力呈增加趋势。

图3 种子物理特性、酶活性、丙二醛含量和电导率与种子活力的函数关系Fig.3 The mathematic relationship between seed vigor and seed physical propertiest，enzyme activities，MDA content and electric conductivity

种子活力与SOD 和POD 活性呈极显著的线性正相关，拟合函数分别为y=5.775xSOD-242.620（R2=0.987，P＜0.01），y=1.129xPOD+93.298（R2=0.947，P＜0.01）。种子活力与MDA含量和种子浸泡液电导率均呈极显著线性负相关，拟合函数分别为y=-1.553xMDA含量+220.500（R2=0.950，P＜0.01）；y=-2.409x电导率+281.150（R2=0.888，P＜0.01）。说明随着种子抗氧化酶活性增强，细胞膜结构的完整性增加，种子活力呈增加趋势。利用这些函数关系可通过抗氧化酶活性、细胞膜结构完整性等生理指标来计算不同成熟期种子的活力。

3 讨论

种子的大小和形态物理指标与种子成熟度有关［31］。本研究发现，花椰菜瓯松60天种子成熟过程中鲜种子千粒重呈降低趋势，但规定水分千粒重在授粉后55、60、65 d之间差异不显著，且明显大于50 d，表明授粉后55 d花椰菜种子内干物质积累已基本完成。这与朱世杨等［24］研究发现花椰菜瓯松90 天授粉后55 d角果性状和种子性状达到稳定的结论一致，与贺振等［10］研究发现玉米授粉后一定天数种子主要物理特性趋于稳定的结论类似。

种子成熟度与种子活力关系较为复杂，明确种子成熟与种子活力之间关系，对指导种子合理采收具有现实意义。赵永泉等［13］发现黄花苜蓿种子活力随种子成熟度增加而增加；樊廷录等［28］则认为玉米杂交种子发芽率先增加后降低再增加变化；王晓敏等［32］认为杂交水稻种子活力先增加后趋于稳定；李诺等［33］则认为成熟度对野生水茄种子活力没有显著影响。本试验在花椰菜研究中发现，随着种子发育天数增加，瓯松60 天种子发芽率、发芽势、活力指数、苗高和根长先增加后趋于稳定，授粉后55 d这些指标趋于稳定，种子发芽率98%，规定水分千粒重4.364 g，且对幼苗生长没有影响，种子已达可采收程度。

种子SOD、POD 能清除活性氧自由基而保护细胞膜的完整性［17-19］，MDA 含量和种子浸泡液电导率间接反映了细胞膜结构的完整性［20-23］。一般随着种子成熟度增加，种子抗氧化酶活性增强，细胞膜结构趋于稳定。本研究发现，随种子发育程度增加，种子SOD、POD 活性先增加后趋于稳定，种子浸泡液电导率和MDA 含量则先降低后趋于稳定，抗氧化酶活性和细胞膜结构稳定性在授粉后55、60、65 d 之间差异不显著，且在55、60、65 d 抗氧化酶活性显著高于50 d，而电导率和MDA 含量显著低于50 d。表明授粉后55 d，花椰菜种子在清除活性氧自由基能力和保护细胞膜结构完整性生理方面已达稳定水平。这与前人在花椰菜［24］、玉米［31］等作物中的研究发现类似。

种子活力能够很好地反映田间出苗质量，是衡量种子质量的重要综合指标［10-12］。理解花椰菜种子物理特性及生理指标与种子活力、种子活力与成熟期之间的关系，对确立品种的适宜收获期以及指导生产高质量种子具有实际意义。本研究发现，种子活力与种子含水量、MDA 含量和电导率呈极显著线性负相关（P＜0.01），与SOD 和POD 活性呈极显著线性正相关（P＜0.01）。表明花椰菜种子活力与抗氧化酶活性、细胞膜结构稳定性等生理指标密切相关，意味着可用SOD 活性、POD 活性、MDA 含量和电导率来推测不同发育程度种子的活力，并进一步预测大田发芽及出苗情况。此外，本试验发现，种子活力指数、SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、电导率与种子成熟期符合二项式函数变化特点，且达到显著或极显著水平。表明花椰菜种子活力、抗氧化酶活性、细胞膜稳定性与种子发育天数回归关系显著，可用来预测不同发育程度种子细胞膜结构的完整性，进而指导高质量种子的生产。

4 结论

随着种子发育天数增加，花椰菜种子活力、SOD和POD 活性先增加后趋于稳定，种子浸泡液电导率和MDA 含量先降低后趋于稳定，表明花椰菜种子清除活性氧自由基能力和保护细胞膜结构完整性随种子成熟期增加而趋于稳定。活力指数与MDA 含量和电导率极显著线性负相关，与SOD 和POD 活性极显著线性正相关；活力指数、SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、电导率与种子发育天数表现出显著或极显著的二项式函数变化规律，因此可用抗氧化酶活性、MDA 含量和电导率来预测不同成熟期种子活力和细胞膜结构的完整性。综上，授粉后55 d，瓯松60 天种子已达可采收程度，发芽率98%，规定水分千粒重4.364 g，种子活力和种子生理趋于稳定，且对幼苗生长没有明显影响，还可降低种子易落粒损失风险，缩短制种周期，降低管理成本。本研究结论是在单个品种进行一个环境下分析得到的，今后还需要利用多个品种在多个环境下全面地分析种子活力及其生理特性与成熟期之间的关系，以更加准确地预测花椰菜杂交种子最佳的收获期。