植物miR396及其靶基因进化、功能与应用研究进展

童嘉琳 楼姝坪 徐云敏， 朱祝军， 何 勇， ，

（1浙江农林大学园艺科学学院，浙江 杭州 311300；2农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 311300）

miR396是一类内源性的非编码小分子RNA（大部分为21～22 nt）。与其他miRNA 相同，miR396 由细胞核中的MIR（miRNA 基因）在RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA Pol Ⅱ）的作用下转录成具有茎环结构的pri-miRNA；接着由类RNase Ⅲ酶（Dicer-like 1，DCL1）切割形成miRNA/miRNA*双链；最后在甲基转移酶（HUA ENHANCER1，HEN1）和染色体区域维护因子1（Chromosomal Maintenance 1，CRM1）蛋白的作用下形成miRNA 成熟体，对靶基因进行切割或翻译抑制［1-4］。近年来研究表明，miR396 可以参与植物生长发育、生物及非生物胁迫响应等过程［5-8］。

miR396 的靶基因包括生长调节因子（growthregulating factor，GRF）、基本螺旋-环-螺旋转录因子（basic Helix-Loop-Helix 74，bHLH74）、短营养期相关基因（short vegetative phase，SVP）、GRAS（含有GRAS 结构域）家族基因成员（scarecrow-like 14，SCL14）、四肽重复样超家族蛋白基因（tetratricopeptide repeat-like superfamily protein，TPR）和氨基环丙烷羧酸氧化酶基因（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）等［9-13］。近年来，miR396 响应环境信号及其分子机制受到广泛关注并取得重要进展［6-8，14］。本研究将从miR396 的保守性与多样性、靶基因、信号响应及其在农业生产上的应用四个方面进行综述，旨在阐明miR396 的调控机制，为丰富转录后水平调控植物生长发育、培育高产、高抗和高养分利用率的新品种等提供参考。

1 miR396的保守性与多样性

miR396存在于所有维管植物中［15］，最早在水稻和拟南芥中被克隆［16］。miRBase（https：//www.mirbase.org）中一共收录了46 种植物，在其中超过30 个物种中鉴定到miR396，不同物种中miR396 成熟序列与数目有所区别。

利用11 个物种中的miR396 成熟体构建系统发育进化树（图1），发现miR396家族可分为6个亚族，第Ⅰ～第Ⅵ亚族分别包含1、7、1、21、15和17个成员。第Ⅵ亚族的miR396 成员最多，分别来自苔藓类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物［17］。花叶溪苔（Apopellia endiviifolia）中pen-miR396b 种子区（seed region）1～6 的碱基与维管植物中miR396 完全一样［18］，说明penmiR396b在进化的过程中具有较高的保守性。miR396的多样性体现在以下3个方面：（1）序列长度的多样性，如花叶溪苔中miR396 序列长短不一，pen-miR396d 为18 个碱基，pen-miR396g 为26 个碱基；（2）碱基的多样性，pen-miR396a/c/d 成熟体的第1 到第5 个碱基序列与维管植物中保守的碱基均不同，维管植物中miR396种子区第7 位碱基为A 或G，第21 位碱基为U 或G（图2）；（3）物种特异性，双子叶植物中miR396 一般为21 个碱基，在单子叶植物中特异存在22 个碱基的miR396，第7 和第8 位点与GRF完全互补配对［17］。综上所述，miR396 在进化的过程中具有保守性与多样性。

图1 利用邻近法构建植物miR396成熟体系统发育进化树Fig.1 The phylogenetic evolutionary tree of mature miR396 constructed by the Neighbor-Joining method

图2 花叶溪苔及部分植物miR396序列Fig.2 The mature miR396 sequences of Apopellia endiviifolia and several other plant species

反向复制假说认为miRNA 来源于靶基因或靶基因片段的反向复制，因此miRNA 的出现时间应晚于其靶基因［3，19-20］。通过时间进化分析发现（图3），大约在992 万年前绿藻（Chlamydomonasreinhardtii）中出现了GRF，约480万年前苔藓类植物中出现了miR396［18-19，21］，进一步对比拟南芥中保守MIR396 前体与GRF2反向互补序列（图4），发现二者具有较高的相似性，因此推测miR396 可能是由GRF反向复制产生。miRNA 也可能通过串联复制、片段复制、全基因组复制或多倍化进行扩张，在复制过程中发生的碱基突变可能是miR396多样性形成的重要原因［22-24］。

图3 miR396及其靶基因在绿色植物系统发育中的出现时间Fig.3 Emergence of miR396 and it’s target genes in green plant phylogenesis

图4 AtMIR396与AtGRF2序列配对Fig.4 Alignments of AtMIR396 and AtGRF2

2 miR396 靶基因——物种间保守的靶基因

2.1 GRF结构特点与分类

GRF是miR396 保守的靶基因，在N 端具有保守的QLQ（谷氨酰胺、亮氨酸、谷氨酰胺）和WRC（色氨酸、精氨酸、半胱氨酸）结构域［1］。QLQ 结构域中包含了编码谷氨酰胺-亮氨酸-谷氨酰胺（QX3LX2Q）的序列，主要负责GRF 和生长调节因子相互作用因子（GRFinteracting factor，GIF）之间的相互作用；WRC 结构域中包含了编码三个半胱氨酸残基、一个组氨酸残基（CX9CX10CX2H）和核定位信号（nuclear localization signal，NLS）的序列，在DNA 结合方面发挥作用，并且具有miR396 成熟体的结合位点［17，25-26］。GRF 蛋白C末端长短不尽相同，较长的C 末端充当反式激活结构域，截短的C末端没有反式激活活性［25］。

Meng等［26］构建了GRF系统发育进化树，将其分为6个亚族。第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅳ、第Ⅵ家族均包含单子叶和双子叶植物，绝大部分苔藓和蕨类植物分布在第Ⅳ亚族中，第Ⅲ亚族只包含双子叶植物，第Ⅴ家族包含蕨类植物和双子叶植物。与高等植物所在的亚族（Ⅰ、Ⅱ）相比，第Ⅳ亚族中GRF 具有较多的外显子和基序数量。根据蛋白结构被子植物中GRF 可分为6 个亚族，第Ⅱ至Ⅵ亚族的GRF 在植物中是保守的，其中Ⅲ亚族中的GRF 则具有较长的C 末端；第Ⅰ亚族的GRF 结构具有多样性，一部分GRF（OsGRF10、ZmGRF4 和SlGRF13）在WRC结构域后有截短的C末端，另一部分GRF（CsGRF5、AtGRF9 和SlGRF10）具两个WRC 结构域，在第二个结构域之后有截短的C末端［17］。

根据是否具有miR396 调控位点，GRF分为受miR396调控和不受miR396调控两种类型，其中大部分GRF受到miR396的调控，仅有少数GRF不受miR396调控。拟南芥9个GRF中，GRF1-4和GRF7-9均受miR396调控［27］；番茄中有13个GRF，其中8个GRF是miR396的靶基因［28］；香蕉（MusananaLour）中存在20个GRF，其中15个被预测为miR396的靶基因［29］；黄瓜中8个GRF均能与miR396 成熟体序列互补配对［17］；蓖麻（Ricinus communis）中11个GRF均包含miR396作用位点［30］。

2.2 miR396-GRF的功能

miR396-GRF模块参与调控根系长短、叶片与花器官大小、以及叶片衰老等。通常过表达miR396后细胞数目减少，器官减小；过表达GRF后细胞数目增多，器官增大。如拟南芥中过表达miR396 及苜蓿（Medicago truncatula）中沉默GRF都降低了根系的长度［11，31］。拟南芥中过表达miR396b降低叶片细胞数目，减小了叶片面积；拟南芥、水稻、杨树和春兰（Cymbidiumgoeringii）中过表达GRF均增大了叶片面积［32-36］。采用短串联模拟靶标（short tandem target mimic，STTM）降低番茄中miR396表达水平，部分GRF上调，花长度增加了22%～25%，萼片长度增加了65%～66%［28，37］。葡萄（Vitisvinifera）中异源表达miR396抗性的突变体rGRF4花序、花梗变长，匍匐本草（Agrostisstolonifera）中过表达miR396 出现雄蕊缺陷的表型［38-39］。此外，过表达miR396拟南芥叶片衰老明显快于野生型，采用幼叶期特异表达的启动子（AS1 和ANT）驱动rGRF3表达后，黑暗条件下叶片衰老加速，表明GRF3表达时期的长短对植株衰老起重要作用［34］。花椒（Zanthoxylumarmatum）中miR396-GRF6模块也参与叶片衰老过程［40］。

miR396-GRF模块还参与种子/果实发育过程。水稻中一共有8个miR396成员，其中miR396e/f突变体植株增加了籽粒大小，其余的miR396 突变体与野生型（WT）相比籽粒大小没有显著差异，说明miR396e/f 是决定水稻籽粒大小的主效功能位点［41］。Zhang 等［32］进一步构建了miR396 抗性突变体rGRF4/6/8，粒径均显著增加。水稻中过表达GRF6，其一级分枝、二级分枝和小穗的数量均显著增加［42］。拟南芥中异源表达大豆miR396b后角果变小［43］。STTM396a/396a-88转基因番茄中，GRF1-5的表达量显著上调，生长阶段的果实重量增加了66%～72%，表皮细胞大小增加了60%～65%［28］。

3 miR396 靶基因——物种间不保守的靶基因

miR396 的靶基因还包括拟南芥中的bHLH74（AtbHLH74）和SVP（AtSVP）、南林985 杨树（Populus euramericana）中的SCL14-1/2/3（PeSCL14-1/2/3）、黄瓜中的TPR（CsTPR）以及枳（Poncirustrifoliate）中的ACO（PtrACO）等（图5）。AtbHLH74与miR396 的结合位点是由pre-mRNA剪接后形成的，抗性突变体rbHLH74根系伸长区细胞长度增加，根系变长［10］。叶片AtbHLH74主要定位于叶脉中，起到调控叶脉脉型和叶片边缘形状的作用［44］。此外，bHLH74也称为隐花色素互作bHLH4（cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 4，CIB4），可以与隐花色素2（cryptochrome 2，CRY2）相互作用并激活成花素基因（FLOWERING LOCUS T，FT）来控制开花时间，过表达miR396拟南芥植株和cib4-1突变体均出现晚花表型［45-46］。目前仅在十字花科（Brassicaceae）和白花菜科（Cleomaceae）作物中发现AtbHLH74同源基因，其功能还有待进一步明确。AtSVP是一种MADS-box转录因子，参与调控植物开花时间，过表达AtSVP拟南芥开花时间晚于野生型，atmir396a-1突变体中AtSVP表达量上升，但没有表现出开花时间异常，可能是由于miR396b 存在冗余功能，导致AtSVP积累量较少，不足以延迟拟南芥开花时间［12］。

图5 miR396与其靶基因序列配对Fig.5 Alignments of miR396 and its target genes

miR396a/c通过切割负调控PeSCL14-1/2/3的表达，参与杨树不定根的形成过程［47］；miR396b-5p 负调控CsTPR的表达，过表达CsTPR的拟南芥植株抗寒性降低［48］；miR396b 可以靶向页调控PtrACO，过表达ptr-MIR396b转基因植株中PtrACO表达量降低，使抗寒性增强［13］。

丹参（SalviamiltiorrhizaBunge）中，miR396b可以靶向HDT1（Histonedeacetylases1）和MYB37/4（MYB-related transcriptionfactor37/4）参与丹参酮和丹参酚的合成过程，miR396b 过表达抑制了转基因丹参毛状根生长，提高了丹参酮含量，降低了丹酚酸含量［49］；黄花石蒜（Lycorisaurea）中miR396负调控酪氨酸脱羧酶（tyrosine decarboxylase1，TYDC1）参与加兰他敏的生物合成［50］；芍药（PaeonialactifloraPall）中miR396b/c 分别靶向1-脱氧-d-5-磷酸木糖还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatereductoisomerase，DXR）和细胞色素P450（cytochromeP450，CYP71A1）参与了单萜类生物合成［51］；丝瓜（Luffacylindrica）中的miR396a 负调控bHLH143参与了类黄酮合成相关途径，miR396b 靶向4-香豆酸辅酶a 连接酶（4-coumarate-CoAligase2，4CL2）参与了花青素合成途径［52］。综上所述，miR396具有许多其他非保守的靶基因，并且这些靶基因的功能只在个别植物中报道过，表明miR396 靶向具有多样性与物种特异性。

4 miR396对不同信号的响应

4.1 对发育信号的响应

miR396 可以响应发育信号参与叶片从幼叶到成熟叶的转变、木本植物从初生生长到次生生长的转变以及种子成熟过程。在拟南芥和黄瓜叶片发育过程中，随着幼嫩叶片的生长miR396成熟体的表达量逐渐上调至一定水平后保持稳定，黄瓜中MIR396A/B/D的表达与成熟体表达趋势一致［17，27］。杨树中miR396 在初生生长向次生生长的过渡阶段IN3（internode）和次生生长基本成熟的阶段IN9 中成熟体表达量较高，过表达miR396a/d 植株在生长前期次生木质部明显加厚并且更早成熟，而过表达GRF15延迟了次生生长［53-54］。此外，miR396在玉米、水稻、小麦籽粒灌浆期间高度表达，并随着籽粒灌浆的推进而逐渐下降，与GRF表达呈显著负相关［55-57］。

4.2 对生物胁迫的响应

miR396 可以响应真菌、细菌等病原体并参与抗病过程。在致病疫霉（Phytophthorainfestans）侵染下，番茄叶片中miR396 的表达显著下降，其靶基因GRF1、GRF4、GRF5和胞嘧啶-5 DNA 甲基转移酶（Cytosine-5 DNA methyltransferase 5，DRM5）的表达量显著上调，过表达miR396 后提高了番茄对致病疫霉的抗性［58］。稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）感染水稻（易感品种）后miR396 的积累量显著增加，过表达miR396 后降低了稻瘟病抗性；过表达GRF8/9增强了稻瘟病抗性［59］。茄子（Solanummelongena）中miR396b 在大丽轮枝菌（Verticilliumdahlia）侵染后下调表达，过表达miR396b植株对病菌更加敏感，GRF2与miR396b表达量变化呈现相反的趋势［60］。miR396 在生物胁迫下响应方式不同，可能与植物和病原体种类有关。

4.3 对非生物胁迫的响应

研究发现miR396可以响应弱光、高温、干旱等非生物胁迫。龙眼（DimocarpuslonganLour）miR396a-3p_2的表达受到光质和光强的影响，蓝光诱导miR396a-3p_2表达。在0～32 μmol·m-2·s-1区间，随着光强增加，miR396a-3p_2 表达量逐渐降低，与其靶基因DNA 定向RNA 聚合酶α 亚基（DNA-directed RNA polymerase subunit alpha，rpoA）的表达量的趋势呈现负相关；但在32～128 μmol·m-2·s-1区间，miR396a-3p_2 与rpoA的表达量随光强的增加而增加［61］；48 ℃高温胁迫下水稻中miR396a/e/f 表达呈上升趋势，其靶基因GRF2的表达呈下降趋势［62］；干旱胁迫（8% PEG8000）下大豆叶片中的miR396 前体表达上调，GRF16-19的表达下调［63］；UV-B 会促进丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MPK3）的表达，拟南芥中UV-B（2 Wm-2UV-B 和0.65 Wm-2UV-A）处理MPK3敲除突变体后miR396上调，GRF1/2/3/6表达下调，叶片细胞数目减少，叶片面积减小［64］。miR396 响应非生物胁迫可能与其启动子序列存在相应的相应元件有关，如水稻、大豆和玉米miR396启动子区域存在光、温度和干旱等响应元件，但其分子机制还有待进一步明确［14］。

4.4 对激素的响应

miR396 可以响应激素的变化参与植物生长发育与抗性调控。黄瓜miR396b-5p 启动子区域有W-box元件，WRKY41/46可以结合W-box 元件，并且WRKY会受到ABA 的诱导，表明ABA 可以激活WRKY41/46-miR396b 这一模块［48］。水稻BR 信号的核心转录激活因子（BRASSINAZOLE-RESISTANT1，BZR1）可以和miR396d 启动子中CGTGT/CG 元件结合正向调节miR396d，过表达MIR396d和沉默GRF4均增加了水稻叶片夹角，表明miR396d 可以响应BR 信号并调节GRF4的表达来控制水稻的叶片夹角［65］。水稻miR396a还可以响应GA 信号，GA 通过泛素化降解DELLA（SLENDER RICE1，SLR1）蛋白，解除了SLR1对miR396的促进作用，从而抑制水稻叶片中细胞的增殖［66-67］。

5 miR396及其靶基因在农业生产上应用

miR396 与其靶基因参与调控作物的重要农艺性状，改变miR396或GRF的表达水平，可提高水稻、番茄等作物的产量、抗性和氮素/水分利用效率等（图6）。水稻miR396ef突变植株种子重量增加，在正常施氮情况下（270 kg·hm-2）产量增加了4%［32］。降低miR396b（MIM396-9 植株）、提高GRF6（OEGRF6 植株）表达均能提高水稻产量［42］。武汉地区田间试验发现，MIM396-9 和OEGRF6 水稻产量分别较野生型增加了16.8% 和18.1%，海南地区水稻产量分别增加了15.4%和17.3%，进一步分析发现MIM396 和OEGRF6转基因植物产量增加可能与小穗数增多有关［42］。郑州和北京的田间试验发现，小麦（Triticumaestivum）中MIM396（沉默miR396）植株的粒径和穗长显著增加，三个株系的千粒重较对照组增加了10%～19%［68］。柳枝稷（Panicumvirgatum）中过表达miR396 降低了植株株高、生物量和木质素，其中木质素含量较野生型降低了15%，过表达GRF9后增加了株高和生物量［69］。过表达OsGRF6/8/9增强了稻瘟病抗性，过表达OsGRF6不仅正调节稻瘟抗性，也增加了产量［55］。MIM396 降低了小麦对白粉病菌（Blumeriagraminis）的抗性，MIM396三个株系的相对菌落面积增加了21%～30%［68］。miR396 还可用于提高植物的氮素/水分利用效率。低氮条件下miR396ef突变植株的产量与正常氮肥条件下野生型的产量相当，缺氮条件下干物质量较野生型提高了25.0%［32］。番茄MIM396 转基因植株叶片气孔减小，密度增加，蒸腾作用降低，GRF的上调促进叶绿体的发育，叶片光合作用较高，提高了水分利用效率［70］。

图6 miR396-GRF模块在农业生产的应用Fig.6 Application of miR396-GRF module in agricultural production

miR396与GRF不仅可以提高作物的农艺性状，其靶基因蛋白GRF还能够和GIF互作以提高植物的再生效率。甜菜（Betavulgarisssp.vulgaris）、油菜（Brassica napus）、大豆（Glycinemax）和向日葵（Helianthusannuus）中，拟南芥GRF5（AtGRF5）在愈伤组织细胞中的异位表达加速了芽的形成，并显著提高了转化效率［71］。此外GRF与GIF可以形成GRF-GIF复合体以提高植株再生效率。西瓜和小麦中，GRF4-GIF1 复合体可以提高植株转化效率，突变GRF4内miR396 靶向位点可以进一步提高再生效率［72-73］。

通过正向遗传学发现GRF高表达种质，可以用于杂交以获得更优良的品种。如GRF4ngr2（GRF4高表达）存在于籼稻品种NM73 中，与GRF4NGR2（GRF4低表达）相比，GRF4ngr2通过阻止miR396介导的GRF4ngr2mRNA18-20的切割，增加GRF4表达量并促进氮吸收和氮同化［74］。与紧凑型黑皮诺（Pinot noir）葡萄群体相比，松散型群体的GRF4的miR396 结合位点突变解除了miR396 对GRF4的抑制作用，从而正向调控细胞增殖过程，促进浆果的数量与大小增加［38］。

6 总结与展望

miR396 的产生可以追溯到苔藓类植物中，可能是由编码蛋白质的基因复制而来。保守的miR396-GRF模块和物种特异性的模块参与响应多种信号，共同决定植物表型。随着理论与技术的不断创新，越来越多的方法（酵母单杂、CRISPR/Cas9、正向遗传学）可以用于研究miR396 功能并应用到实际农业生产中［48，75-76］。水稻、番茄及葡萄相关试验表明，miR396-GRF在农业生产利用上具有较高的价值，可以提高作物产量、抗病性和氮素/水分利用效率。虽然miR396 的功能得到了一定的解析，但在调控机制方面仍有许多问题亟待解决，如miR396响应生物与非生物胁迫信号的分子机制等。未来，一方面可以利用生物信息学分析和实验（酵母单杂、双荧光素酶）相结合，挖掘更多miR396上游调控转录因子。另一方面可以通过CRISPR/Cas9 技术实现作物中miR396 表达水平的精准调控以优化植物表型或者通过正向遗传学发掘GRF高表达的种质，并与其他优良材料杂交获得高产及抗逆性强的新品种。