辣椒HD-Zip基因家族鉴定、系统进化及表达分析

邵晨冰，黄志楠，白雪滢，王云鹏，段伟科

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003）

0 引言

【研究意义】辣椒（Capsicum annuum），属茄科（Solanaceae）茄亚族（Solaninae Dunal）辣椒属一年生或多年生植物，是我国重要的蔬菜作物，近几年种植面积及产量均居世界首位（http://faostat.fao.org）。HD-Zip转录因子（homeodomain-leucine zipper，HD-Zip）是植物中特有的一类转录因子，参与调控植物光合作用、形态建成以及逆境胁迫应答等重要生长发育过程[1-2]。通过在辣椒基因组中系统鉴定HD-Zip基因家族成员，并对其染色体定位、基因结构、进化关系和表达特征进行分析，对进一步认识辣椒生长发育过程及培育改良辣椒品种具有重要意义。【前人研究进展】HD-Zip转录因子属于同源异形域（Homeodomain，HD）转录因子超家族，参与调控正常生长条件和环境胁迫后植物的生长发育[3]。该转录因子均由同源异型域及亮氨酸拉链（leucine zipper，LZ）结构域共同构成。HD和LZ结构域的存在共同决定了该类蛋白的转录因子功能[1]。根据基因序列的保守性及结构特点，该家族可被分为4个亚族，HD-Zip I—IV：HD-Zip I亚族只包含HD和LZ结构域；II亚族另包含一个N端保守区域（N-term）；III亚族较复杂，包含除HD和LZ结构域之外的START、SAD和MEKHLA结构域；IV亚族与III亚族类似但没有C端的MEKHLA结构域[1]。HD-Zip基因家族不同亚族参与不同的代谢途径[1]。以模式植物拟南芥为例，HD-Zip I在非生物胁迫（ATHB1、ATHB5、ATHB6、ATHB7、ATHB12）[4]，光信号转导（ATHB16）[5]，叶片发育（ATHB1、ATHB3、ATHB16和ATHB20）[4]等方面发挥重要的作用；HD-Zip II主要在植物发育过程中参与环境改变应答机制，特别是光质改变应答调控（ATHB2、ATHB4、ATHB2）[6-7]；HD-Zip III主要参与胚胎发育（PHB和PHV）[8]，茎和花分生组织形成（ATHB15、ATHB8、REV）[9]和维管发育（REV、ATHB15）[10-11]等；HD-Zip IV则主要在植物毛状体的形成（HDG11、HDG12、GL2）[12]，表皮细胞的发育（ATHB10、PDF2、AtML1）[13]，叶片形态和生殖细胞发育（HDG1）[14]，花色素苷积累（ANL2）[15]等过程起重要作用。HD-Zip的同一亚族在不同植物中具有相似的功能。但由于物种和环境的差异，特别是不同植物在进化过程中经历了不同选择、复制和保留事件，HD-Zip基因家族同源基因在不同物种中均有不同程度的分化。比如油椰子（Elaeis guineensis）中的EgHOX1（II亚族），该基因参与早期体胚的形成，并且影响了形成层发育中胚性能力的获得[16]。番茄中的13条HD-Zip IV基因在新叶和花朵中高度表达，对不同的植物激素和非生物胁迫具有应答作用[17]。【本研究切入点】目前，该家族基因已经在拟南芥[1]、葡萄[18]、玉米[19]等多个物种中被鉴定，并发现其发生不同程度的功能分化。辣椒的全基因组测序在两个品种‘CM334’及‘遵辣1号’中已完成[20-21]，为研究相关基因的功能及关系奠定了坚实的基础。虽然该家族在‘CM334’基因组中进行了初步分析[22]，但进化及表达数据分析较少，并未进行深入研究和比较分析。【拟解决的关键问题】本研究利用生物信息学手段鉴定辣椒HD-Zip基因家族，并系统分析其在基因组中的分布、基因结构、进化分化特征及在不同组织中的时空表达特异性，为阐明辣椒HD-Zip基因家族分化历程及生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

试验于2018—2019年在淮阴工学院园艺作物系统生物学实验室进行。

1.1 辣椒HD-Zip基因家族成员的鉴定

本研究主要基于我国辣椒测序品种‘遵辣1号（Zunla-1）’进行系统分析，同时利用墨西哥地方品种‘CM334’进行比较分析。研究中使用的辣椒基因组数据分别从辣椒基因组网站（Pepper Genome Database2.0，http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp）及PGP（Pepper genome platform，http://peppergenome.snu.ac.kr/）下载获得。

参照前人报道[1]及PlantTFDB（Plant Transcription Factor Database http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）确定拟南芥HD-Zip基因家族成员。随后，将其作为诱饵利用本地BLAST工具在辣椒基因组中进行比对（参数为E＜1e-10，Identity＞40%），获得与拟南芥同源性高的HD-Zip序列信息，并利用Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/search）及SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）进行验证分析，删除缺失结构域的序列，最终获得辣椒HD-Zip基因家族候选基因。

辣椒HD-Zip家族成员蛋白分子量和等电点利用在线工具EMBOSS Programs（https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）进行分析鉴定。

1.2 辣椒HD-Zip基因家族系统进化树构建和分组确定

利用CLUSTALW将拟南芥及辣椒HD-Zip氨基酸序列进行多序列比对分析[23]。并通过邻接法（Neighbour-Joining，NJ）在MEGA 6.0中构建系统进化树，自展值（Bootstrap）设定为1 000。HD-Zip基因的核苷酸差异同样应用MEGA6.0进行计算[24]。

1.3 辣椒HD-Zip家族成员结构和保守结构域分析

HD-Zip的外显子和内含子位置信息参考辣椒基因组注释信息GFF文件，之后应用本地perl语言提取位置信息转变为GSDS（Gene Structure Display Server；http://gsds.cbi.pku.edu.cn）可读bed文件。应用在线工具GSDS进行HD-Zip结构的绘制。

应用MEME 4.9.0预测分析HD-Zip蛋白序列的结构域，搜寻motif值设置为16，结构域宽度设定为最小10、最大100，其他设定为默认参数。通过TBbool软件绘制出MEME结构[25]。HD及LZ结构域通过SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）数据库分析确定。

1.4 辣椒HD-Zip基因家族染色体定位和基因复制类型分析

应用本地perl语言在辣椒基因组注释信息GFF文件中提取位置信息并构建辣椒染色体定位图。HD-Zip在辣椒基因组中的复制类型根据MCScanX下游程序duplicate_gene_classifier获得[26]，并标注在染色体上。

1.5 HD-Zip直系（Orthologous）和旁系（Paralogous）同源基因分析

辣椒、番茄和拟南芥HD-Zip的直系与旁系同源关系通过OrthoMCL（http://orthomcl.org/orthomcl/）软件进行鉴别，HD-Zip在3个基因组中的直系与旁系之间的关系图用Circos（http://circos.ca/）软件绘制。

1.6 辣椒HD-Zip的组织表达差异分析和共表达网络构建

通过GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获得‘遵辣1号’材料不同时期的转录组（GSE45037）注释文件[21]，运用R软件绘制辣椒HD-Zip基因家族的表达热图。

辣椒HD-Zip在不同组织之间的表达关系皮尔森相关系数（Pearson’s correlation coefficient，PCC）通过本地perl语言进行计算，显著相关共表达基因对的网络显示利用Cytoscape 3.1进行构建。

2 结果

2.1 辣椒HD-Zip基因家族的成员分析和分组鉴定

利用生物信息学方法并经过后续的筛选验证，从辣椒‘遵辣1号’全基因组中共鉴定到42个HD-Zip家族成员，根据染色体顺序依次命名为CaHDZ01—CaHDZ42，其中基因CaHDZ42并没有锚定在染色体（表1）。

辣椒中HD-Zip家族基因长度介于459 bp（CaHDZ38）和2 529 bp（CaHDZ03）之间；分子量从最小18.09 kD（CaHDZ38）到最大93.61 kD（CaHDZ03）不等；等电点介于4.20（CaHDZ40）至9.36（CaHDZ08）之间。因此，HD-Zip基因家族的基因长度跨度很大，且与分子量具有相关性，而pI主要取决于氨基酸中酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比，大多数CaHDZ蛋白（70%）的pI小于7.0，证明其可能是一类酸性蛋白（表1）。

基因序列若高度同源，则可能具有相似的功能。在拟南芥HD-Zip与辣椒的HD-Zip基因家族成员对比结果中可知，大多数辣椒HD-Zip与拟南芥具有高度同源性（E-value=0，表1），为指导辣椒HD-Zip基因家族的生物学功能研究提供了参考。

图1 辣椒、拟南芥HD-Zip基因家族系统进化树Fig.1 The unrooted phylogenetic tree of HD-Zip gene family between pepper and Arabidopsis

为进一步了解辣椒HD-Zip基因家族和拟南芥之间的同源关系，构建了辣椒、拟南芥HD-Zip基因家族系统进化树（图1）。由图可知，与拟南芥一样，辣椒HD-Zip基因家族可分为4个亚族（为I、II、III和IV）。在辣椒基因组中这4个亚族分别含有18、9、5、10个HD-Zip，I、II、III亚族数目与拟南芥中类似，其中III亚族基因个数一致，证明这3个亚族HD-Zip并没有在辣椒基因组中大范围变化，而辣椒中IV组基因明显比在拟南芥中减少，可能是在辣椒全基因组复制过程中丢失较多（图1）。

2.2 辣椒HD-Zip基因家族的结构特征分析

从图2可以看出辣椒HD-Zip基因家族中4个亚族的基因结构有显著差别。整体看来，I、II亚族的基因编码序列较III和IV亚族结构简单，I亚族外显子数目最少，均为2—3个，II亚族为3—4个，而III、IV亚族成员外显子数目多在10个以上（图2-B）。大多数进化树节支点的基因具有类似的外显子结构，但从基因全长来看，相似的CDS长度却有不同的基因全长，说明内含子长度具有较大的差异性。

同时，对辣椒HD-Zip基因家族进行了蛋白保守结构域分析，共鉴定获得16个保守基序（Motif），将这些Motif进行了注释。Motif 1和2对应HD，Motif 3对应LZ。结果表明，辣椒HD-Zip成员均含有HD和Zip结构域，但部分成员的HD结构域并不完整，如第I亚族中CaHDZ15和III亚族CaHDZ39缺失了部分HD结构域（Motif 2）。此外，IV亚族HD结构域中多了Motif 7（图2-C）。从4个亚族的结构来看，与前人一致，I亚族只包含HD和Zip两个结构域；II亚族除CaHDZ38外，motif多集中于序列后半段；III亚族和IV亚族含有另外的结构域，但它们之间并不完全保守（图2-C）。

图2 辣椒HD-Zip基因家族成员的结构特征Fig.2 An analytical view of HD-Zip family in pepper

2.3 辣椒HD-Zip基因家族的染色体定位分析

依据辣椒CaHDZ染色体位置信息，除CaHDZ42外，剩下41条基因不均匀地分布在12条染色体上（图3）。其中1号、2号、3号染色体上分布的基因较多，分别有6条、9条和7条。2号染色体上的基因大多分布在其下端，3号染色体的基因大多分布在其上端，8号和9号染色体上最少，均只分布有1条HD-Zip家族基因，其余染色体在2—4条。通过4个亚族基因在染色体上分布情况比较，发现I亚族基因主要集中在2号和3号染色体上，其余亚族成员不均等分布在染色体上。部分染色体仅有单个亚族的成员，比如4号、5号和9号仅有I亚族基因，8号染色体仅有III亚族基因，推测在辣椒三倍化快速扩增过程中并未均等的发生片段复制，或者复制后HD-Zip丢失较多。

此外，通过MCScanX及下游程序对所有基因进行共线性和复制基因分析，结果表明，CaHDZ01/CaHDZ20、CaHDZ12/CaHDZ24、CaHDZ26/CaHDZ40、CaHDZ10/CaHDZ27都发生了片段复制。片段复制使得基因数目增多，特别是I亚组基因数目的增加。

图3 HD-Zip在辣椒染色体上的位置Fig.3 The chromosome location of the HD-Zip genes in pepper

2.4 辣椒、番茄和拟南芥HD-Zip直系、旁系同源基因的鉴定

在对辣椒、番茄和拟南芥3个物种内部直、旁系同源基因的对比研究中（图4），发现在3个物种中直系同源基因对都很多，这可能是由于HD-Zip序列极度保守和相似。在表1中，辣椒和拟南芥HD-Zip的比对结果也表明大部分基因对的E值都很小，甚至为0，证明这类基因极保守，特别是第III亚组基因。此外，通过比较3个物种中的直系同源基因对数目，发现直系同源基因对大体相同，但辣椒和番茄之间的稍多于其他组，表明辣椒与番茄两物种间的基因相似度高，有较高的保守性。这也与辣椒和番茄的亲缘关系相一致，一般亲缘关系越近，两物种间的同源基因对就越多。而旁系同源基因的鉴定结果则表明，拟南芥中要明显多于番茄和辣椒，辣椒中最少，说明辣椒基因组的倍增事件并没有导致HD-Zip的明显扩增，或者是基因组复制后基因丢失较多。

图4 拟南芥、番茄和辣椒的直系及旁系同源HD-Zip的分布Fig.4 Circle plots of paralogous and orthologous HD-Zip pairs between Arabidopsis thaliana, Solanum lycopersicum and Capsicum annuum

2.5 HD-Zip基因家族进化特征分析

为进一步明确HD-Zip基因家族进化特征，分别选取无油樟（Amborella trichopoda）、水稻（Oryza sativa）[19]、玉米（Zea mays）[19]、番茄（Solanum lycopersicum）[17]、马铃薯（Solanum tuberosum）[27]、辣椒‘CM334’、辣椒‘Zunla-1’、毛果杨（Populus trichocarpa）[28]、葡萄（Vitis vinifera）[18]以及拟南芥[1]9个代表物种进行分析（表2、图5）。与孑遗植物无油樟相比，HD-Zip在其余8种植物中具有不同程度的倍增（表2），证明其在不同的进化过程中被不均等的复制保留下来。系统进化树分析表明，包含无油樟在内这9个物种的HD-Zip序列不均等的分布在4个亚族中，说明从被子植物开始，HD-Zip基因家族就稳定存在4个亚族。在这9个物种中，I亚族含有最多的数目，而III数目最少（图5-A），证明在被子植物全基因组复制过程中I亚族复制保留的基因最多，而III亚族基因没有发生复制或复制后丢失。这也侧面证明III亚族基因可能相对比较保守。

表2 HD-Zip在不同物种中数目情况统计Table 2 Numbers of HD-Zip genes in different species

图5 HD-Zip基因家族4个亚族之间的关系Fig.5 Phylogenetic relationship of HD-Zip gene family and characteristic of the four groups

通过系统进化树来看，I和II亚族具有较近的亲缘关系，而III和IV亚族亲缘关系较近（图5-A）。为研究这4个亚族基因之间的亲缘关系，分别鉴定了它们之间的核苷酸差异。从图5-B中可以看出，III亚族基因内部的核苷酸差异最小，证明该亚族基因非常保守，与前期结果一致。I亚族基因的平均核苷酸差异最大，但与II和IV亚族并未有明显差异。II和IV亚族基因内部的核苷酸差异则更加分散，证明II和IV亚族基因发生了明显的分化。从不同亚族之间的差异来看，I和II亚族基因之间核苷酸差异最小，表明I和II亚族亲缘关系最近，其次是III和IV亚族。根据结果可以推测最先存在的HD-Zip基因家族可分为两组，其中一组分化成I和II亚族，而另一组则分化成为III和IV亚族。

2.6 辣椒HD-zip基因家族在不同组织中表达模式分析

对42个辣椒HD-Zip在根、茎、叶、花芽、花和果实不同发育时期的表达模式进行分析。结果显示，该家族基因的4个亚族具有不同程度的表达趋势，其中I亚族中的基因在辣椒不同组织中的表达量相对较高，且亚族内部呈现出不同的表达模式，近一半基因在辣椒不同组织及果实发育前期均具有较高的表达量，证明这部分基因对辣椒的生长发育，特别是果实成熟前期具有重要的作用（图6）。其中，CaHDZ22在茎中的表达程度最强，表明该基因可能对辣椒茎的生长有重要作用（图6）。较I亚族相比，II、III和IV亚族基因在不同组织中的表达量相对较低，但部分基因在特定组织中具有较大的表达量，例如CaHDZ13在根、茎、芽、叶、花和果实成熟前期具有较高的表达量，CaHDZ34在辣椒果实成熟后期具有较大的表达量，CaHDZ02和CaHDZ28在果实刚刚膨大时具有较高的表达量，CaHDZ04在果实成熟前期具有较大的表达量，证实这些基因在辣椒的特定时期均具有重要的作用（图6）。此外，CaHDZ09、CaHDZ42和CaHDZ41这3个基因在根、茎、芽、叶、花和果实成熟过程中均不表达。

此外，I亚族中大多数基因在根、茎、芽、叶和花中的表达程度相差不多。为了更好地了解辣椒HD-Zip及其同源基因之间的表达差异，通过筛选皮尔森相关系数（PCC，P＜0.05）显著共表达基因对，构建了辣椒HD-Zip表达网络（图7）。该网络包含35个节点（基因）和87个边（调控关系），有33对基因表达趋势PCC大于0.8，6对大于0.9，CaHDZ14/CaHDZ22及CaHDZ07/CaHDZ02之间的PCC达到0.96。虽然在不同组织中表达有强有弱，但具有明显共表达趋势。除了正向协同，另外有9对CaHDZ之间为负调控关系。以上结果表明HD-Zip在调控植物生长发育过程中起到了重要的协同作用，并且不同亚族之间也具有一定的协同性（图7）。

图7 辣椒HD-Zip共表达网络Fig.7 Co-expression network of HD-Zip genes in pepper

3 讨论

植物转录因子通过其特有结构域与DNA及其他蛋白或转录因子间的相互作用，激活或抑制基因的表达来调控植物正常的生理过程或应激反应[3]。HD-Zip蛋白是植物界所特有的一类转录因子，包含4个亚族，而不同亚族的结构域差异又决定了其功能的多样性[1]。随着分子生物学技术的发展，模式植物拟南芥中的HD-Zip家族成员功能均已被解析，证实不同亚族间确实存在多样性的功能[1,4,8,12]。但在进化过程中，随着不同物种经历的不同复制选择事件，同源基因发生不同程度的分化，常见的是产生次功能（Subfunctionalization）、产生新功能（Neofunctionalization）和丢失复制基因或功能冗余这3种类型[29]。HD-Zip基因家族目前已经在多个植物中被详细鉴定，包括拟南芥[1]、玉米[19]、葡萄[18]、毛果杨[28]等。研究结果表明该家族成员具有较高的系统发育相似性，但是在不同物种中表现出不同的时空表达模式，并具有明显的组织差异性表达，对植物生长发育的调控也存在功能分化和冗余的现象。此外，尽管感知同样的环境胁迫因子，但是不同成员在同样的环境胁迫下的调控方式并不相同[1,30]。

辣椒基因组经历了快速三倍化扩增[20-21]，给研究重要基因复制分化提供了很好的基础。本研究从我国自主选育的辣椒‘遵辣1号’基因组中鉴定获得42条HD-Zip，在‘CM334’中鉴定得到45条HD-Zip，经过FGENESH对基因序列进行手动矫正和重新注释，最终确定以‘遵辣1号’基因组为主要研究对象。42条HD-Zip中除了1条没有被锚定在染色体上，剩下41条不均等地分布在辣椒12条染色体上。通过共线性分析，发现片段复制是CaHDZ基因家族扩增的主要原因，这和马铃薯、拟南芥一致[1,27]。CaHDZ基因家族4个亚族成员的数目并不均等，I亚族最多且主要集中在2号染色体上，III亚族最少，这和拟南芥中的类似[1]。辣椒中IV亚族发生了丢失，但在拟南芥中，IV亚族保留的较多。同时，I亚族发生片段复制的基因数量最多，这可能是I亚族基因数目最多的原因。III亚族基因相对比较稳定，并未发生复制事件或复制后丢失。在所选的9个代表物种中，同样发现I亚族扩增最为明显。特别是在茄科植物中，I亚族基因数目占比达到40%以上。IV亚族基因在被子植物中也发生了比较明显的扩增，但在‘遵辣1号’中该亚族基因数目占比只有24%，发生了明显的丢失。III亚族在多个物种中均只有5条基因，相对比较保守。核苷酸差异分析结果表明III亚族基因内部的核苷酸差异确实最小，证明在物种进化过程中III亚族基因的选择压力比较小，因此基因也比较保守；而剩下3个亚族核苷酸差异较大，特别是I亚族，且差异比较分散。可以推测在进化过程中这3个亚族的基因，具有较大的选择压力，更容易进化出新的功能[29,31]。通过不同亚族之间的差异来看，I和II亚族亲缘关系最近，其次是III和IV亚族。由此推测I和II亚族、III和IV亚族可能分别从相同的祖先分化而来，或者IV亚族是从III亚族分化而来。

基因结构是研究基因功能和进化的重要依据，本研究详细分析了辣椒HD-Zip基因家族的结构特征和保守结构域。辣椒HD-Zip同一亚族的基因，其结构相似。从外显子数目来看，I亚族最少，III亚族最多，这和玉米[19]、毛果杨[28]等一致。III和IV亚族基因长度显著长于I和II组，证明其有更加复杂的结构特征，保守结构域分析也印证了这一点。I和II亚族基因的保守结构域基本只包含了特有的HD和Zip结构域，而III和IV保守基序更加复杂。III亚族中还包含START、SAD和MEKHLA结构域，而IV亚族则包含START和SAD结构域[1,8,12]，这与前人研究一致[1,6,13]。此外，III和IV亚族中的START和SAD结构域在两组间并不完全保守，而在亚族内部很保守，可能在功能上也具有不同的表达模式。

辣椒HD-Zip存在明显的组织差异性表达，I亚族差异最为明显，而III亚族差异最小。这也证实了上面的推测，I亚族确实发生了明显的功能分化，在不同物种中可能参与更多的代谢与发育过程[4]。I亚族基因在黄瓜中可以响应多种环境信号[32]，烟草NaHD20可以调控花的发育[33]，蒺藜苜蓿中HB1在一定条件下可诱导其在初生根和侧根中表达[34]。在辣椒中，发现I亚族基因在茎中表达的基因最多，且表达量最大，特别是CaHZD22在茎中具有最高的表达，证明该类基因对辣椒茎的发育起到重要作用。此外，CaHZD18在根中表达量最大，CaHZD12和CaHZD22在花中表达量最大，CaHZD12和CaHZD07在果实成熟前期表达量最大，CaHZD18和CaHZD20在果实成熟后期有较大表达量，证明该亚族基因对辣椒的形态建成和果实发育具有重要的作用。虽然辣椒I亚族发生了明显的功能分化，但和拟南芥直系同源相比，仍具有一定的功能相似性，ATHB1、ATHB3、ATHB16和ATHB20[4-5,35-36]参与叶片生长发育过程，CaHZD15、14和40在叶片中具有较高的表达量，可能参与了叶发育过程。辣椒中III亚族基因变化趋势并不显著，说明在不同组织发育和果实发育过程中功能分化并不明显。通过和拟南芥中同源基因相比也具有一定的相似性，拟南芥该组基因主要在植物发育过程和维管发育中起作用[8]，辣椒中该基因也在植物组织中特别是茎中具有高表达。另外，辣椒的II和IV亚族基因也发生了不同程度分化，虽然HD-Zip在辣椒中发生了明显的表达分歧，但其仍有一定的共表达趋势，证明其在调控植物生长发育过程中起到了重要的协同作用。此外，为维护植物的正常生长发育，同一家族基因会存在一些抑制性表达调控。

4 结论

本研究在辣椒中共鉴定到42条HD-Zip，根据进化关系和结构特征分为4个亚族，不同亚族的基因结构、蛋白保守结构域及表达模式不同；CaHZD不均等地分布在12条染色体上，并有多个基因发生了片段复制；在进化历程中，CaHZD保守性高，数目没有明显倍增，III亚族最为保守，I和II亚族、III和IV亚族亲缘关系更近；CaHZD具有明显的组织差异性表达，协同调控了辣椒的生长发育。