暖宫七味散中挥发性成分超临界CO2 提取及定性定量研究

2024-01-29高彦全刘卫东梁国栋李慧慧彭佩瑾王少峡刘志东祁东利

中成药 2023年12期

高彦全，刘卫东，梁国栋，李慧慧，彭佩瑾，王少峡，刘志东，祁东利*

（1.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617； 2.天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 301617； 3.天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617； 4.内蒙古大唐药业股份有限公司，内蒙古呼和浩特 01001； 5.内蒙古自治区蒙药新药企业重点实验室，内蒙古呼和浩特 01001）

暖宫七味散是蒙古族传统特色方药，出自《观者之喜》，由白豆蔻，肉豆蔻，丁香，沉香，天门冬，手掌参和黄精组成，具有抑制心、肾赫依，调经养血，暖宫止带等功效，现代临床常用于治疗妇科痛经、月经不调、更年期综合征、不孕不育等症［1-3］。暖宫七味散质量标准研究薄弱（《卫生部药品标准》蒙药分册ZZ8423），有学者［4-5］分别采用气相色谱法和高效液相色谱法测定了暖宫七味散中桉油精和丁香酚含量，此外，巴根那等［6］补充了白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香的薄层色谱鉴别；侯峰等［7］增加了显微鉴别、气相色谱法鉴别豆蔻中桉油精及测定方中总丁香酚含量。

白豆蔻和肉豆蔻化湿行气、醒脾开胃［8-9］；丁香温中降逆、补肾助阳［10］；沉香行气止痛、温中止呕［11］。挥发性成分为其主要药效物质，如豆蔻挥发油具有抗氧化、抗菌、镇痛等药理作用；丁香酚等酚类物质具有抗炎、保护肝肾损伤、保护神经细胞对抗阿尔兹海默病等重要活性［12-16］；沉香挥发油具有抗炎镇痛、抑菌等多种药理活性［17］。

本实验采用超临界CO2萃取法和水蒸气蒸馏法提取暖宫七味散的挥发性成分，用GC-MS 进行成分鉴别，选用含量高、活性明确且与复方疗效一致的成分建立对应含量测定的质量控制方法，以期为完善暖宫七味散质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器超临界CO2萃取装置（型号HA320-40-21，南通市华安超临界萃取有限公司）； XP-205 型天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； WN-V69-6006 型天平（十分之一，厦门巨林仪器有限公司）； EN1434 型天平（千分之一，上海民桥精密科学仪器有限公司）； FW177 型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）； KQ-400KDE 型数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）； Agilent 7890B 气相色谱仪，串联Agilent 5977A 质谱仪（美国Agilent 公司）。

1.2 试剂与药物白豆蔻（批号20170413）、沉香（批号20171031）、肉豆蔻（批号 20170414）、丁香（批号20161115）药材均由内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司提供，经天津中医药大学祁东利老师鉴定为正品。丁香酚对照品（纯度≥99.6%，批号110725-201716）、桉油精对照品（纯度100%，批号110788-201707）购自中国食品药品检定研究院；去离子水由超纯水机（Millipore-Q）制备；无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷均为分析纯，购自天津市康科德科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取

2.1.1 水蒸气蒸馏法按照暖宫七味散原处方比例称取含挥发油的4 味药材（白豆蔻、沉香、肉豆蔻、丁香共225 g）混合，参照2015 年版《中国药典》一部修订版附录XD 挥发油测定法甲法提取挥发油至挥发油体积不再增加，收集挥发油，平均得率为4.11 mL／100 g。

2.1.2 超临界CO2萃取法按照暖宫七味散原处方比例称取含挥发油的4 味药材（白豆蔻、沉香、肉豆蔻、丁香共2.5 kg）混合，粉碎后置于超临界CO2萃取釜中，在2 种萃取条件下进行提取。

萃取条件1：萃取温度45 ℃，萃取压力28 MPa，CO2体积流量50 L／h，分离I 压力9 MPa，分离I 温度65 ℃，分离Ⅱ温度35 ℃，分离Ⅱ压力为常压，萃取90 min，收集精油（常温液体）即得，其得率为4.50 mL／100 g。

萃取条件2：萃取温度50 ℃，萃取压力28 MPa，CO2体积流量50 L／h，分离I 压力9 MPa、温度65 ℃，分离Ⅱ温度35 ℃、常压，萃取90 min，收集精油（常温液体）即得，其得率为4.52 mL／100 g。

2.1.3 2 种提取方式比较如表1 所示，与水蒸气蒸馏法相比，超临界CO2提取挥发性成分得率提高10%，投药量大，用时短，能耗低。

表1 2 种提取方式比较

2.2 GC-MS 定性分析

2.2.1 GC-MS 条件色谱：HP-5MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温（初始温度60 ℃，保持2 min，以5 ℃／min 升温至250 ℃，保持20 min）；进样口温度280 ℃；载气高纯He （99.999%）；柱前压19 psi（1 psi＝6.895 kPa）；分流比150 ∶1；进样量0.2 μL。

质谱：电子轰击EI 离子源70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；电子倍增器电压1 680 V；质谱延迟时间1.5 min；正离子模式采集数据；质量扫描范围m／z30～550。

2.2.2 结果得到19 个化合物，匹配度均为100%，GC-MS总离子流图见图1，其中化合物6、12、3、2、16、14、1、11 这8 个化合物的峰面积百分比占总峰面积的91.45%。

图1 挥发油样品的GC-MS 总离子流图

总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索并与Nist 14.L 标准质谱图核对，质谱鉴别结果见表2，化合物6 桉油精的峰面积百分比最高（49.35%），其次是化合物12 （丁香酚，16.01%）、3 （β-蒎烯，6.59%）、2 （桧烯，6.21%）、16 （ 2-甲氧基-4- （ 1-丙烯基）-苯酚乙酸，4.77%）、14 （石竹烯，3.81%）、1 （1，3，3-三甲基-三环［2.2.1.02，6］庚烷，2.86%）、11 （ α-松油醇，1.85%）。

表2 挥发油成分GC-MS 鉴定结果

桉油精具有抑菌、抗炎、镇痛、神经保护、降血脂、防治糖尿病的药理作用［18-21］，丁香酚具有抗氧化应激、抗炎、抗病毒、局部麻醉、镇痛等作用［22-25］，与暖宫七味散抑赫依、强身、调经养血、暖宫止带等功效契合，能一定程度上代表暖宫七味散治疗疾病的药效物质基础，故选择桉油精和丁香酚作为指标性成分建立含量测定方法，用于暖宫七味散的质量控制研究。

2.3 暖宫七味散中桉油精、丁香酚含量的测定2.3.1 色谱条件 Agilent DB-WAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； FID 检测器；程序升温（起始温度80 ℃，保持3 min，以10 ℃／min 升至190 ℃，保持10 min）；分流比40 ∶1，进样口温度240 ℃，检测器温度280 ℃；载气N225 mL／min，燃气H240mL／min，助燃气空气350 mL／min；进样量1 μL；柱流量1 mL／min。

2.3.2 对照品溶液制备精密称取桉油精对照品71.03 mg于10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1 mL 含桉油精7.10 mg 的对照品溶液。

精密称取丁香酚对照品125.13 mg 于10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1 mL 含丁香酚1.25 mg 的对照品溶液。

精密吸取桉油精对照品溶液5 mL，丁香酚对照品溶液2 mL 于10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，制成1 mL 含桉油精3.55 mg、丁香酚2.50 mg 的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备与优化

2.3.3.1 评价指标药材中桉油精含量提取液中桉油精质量／投入药材总质量×100%，药材中丁香酚含量＝提取液中丁香酚质量／投入药材总质量×100%。

2.3.3.2 有机溶剂种类考察（n＝6）取暖宫七味散挥发性药材适量，粉碎，过3 号筛，按照1／50 处方量精密称取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于一定体积具塞三角瓶中，加入10 倍量有机溶剂（依次考察无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷），称定质量，室温条件下，超声功率400W，超声提取30 min，冷却后再次称定质量，补足减失的质量，摇匀，滤过，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定桉油精、丁香酚含量。结果表明，当选用乙酸乙酯时，提取所得桉油精的含量为2.83%，高于无水乙醇组，略低于正己烷组；丁香酚的含量为1.57%，高于其余2 组，两者兼顾，故选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

2.3.3.3 料液比考察（n＝6）取暖宫七味散挥发性药材适量，粉碎过3 号筛，按照1／50 处方量精密称取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于一定体积具塞三角瓶中，加入一定量（依次考察10、15、20、25、30 倍量）乙酸乙酯，称定质量，室温条件下，超声功率400 W，超声提取30 min，冷却后再次称定质量，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定桉油精、丁香酚含量。结果表明，在其余条件不变的情况下，药材质量与溶剂用量比例为1 ∶25 时，桉油精含量为3.02%，高于其余各组；丁香酚含量为1.51%，与相邻组别差异不大，较为稳定，故选用药材质量与溶剂用量最佳比例为1 ∶25。

2.3.3.4 超声功率考察（n＝6）取暖宫七味散挥发性药材适量，粉碎过3 号筛，按照1／50 处方量精密称取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于一定体积具塞三角瓶中，加入25 倍量乙酸乙酯，称定质量，室温条件下，考察240、280、320、360、400 W，超声提取30 min，冷却后再次称定质量，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定桉油精、丁香酚含量。结果表明，在其余条件不变的情况下，超声功率为280 W时，桉油精含量为3.11%，远高于其余各组；丁香酚含量为1.59%，且后续基本未增长，故选用最佳超声功率为280 W。

2.3.3.5 超声时间考察（n＝6）取暖宫七味散挥发性药材适量，粉碎过3 号筛，按照1／50 处方量精密称取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于具塞三角瓶中，加入25 倍量乙酸乙酯，称定质量，室温条件下，超声功率280 W，依次考察超声20、30、40、50、60 min，冷却后再次称定质量，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定桉油精、丁香酚含量。结果表明，在其余条件不变的情况下，随超声时间延长，桉油精和丁香酚含量均呈先增加再降低的趋势，当超声50 min 时，桉油精和丁香酚含量均达到顶峰，分别为3.26%和1.71%，故选择最佳超声时间50 min。

2.3.3.6 最佳供试品制备方法验证（n＝12）由上述超声提取工艺考察可知，暖宫七味散挥发性药材中挥发油超声提取最佳供试品制备方法为：以乙酸乙酯为提取溶剂，料液比为1 ∶25，280 W 功率，超声50 min。

取暖宫七味散挥发性药材适量，粉碎过3 号筛，按照1／50 处方量精密称取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，共12 份，分别置于一定体积具塞三角瓶中，按照最佳供试品制备方法制备，摇匀，取一定体积滤液过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液按“2.3.1” 项下色谱条件测定桉油精、丁香酚含量。结果显示暖宫七味散挥发性药材中桉油精含量为3.04%，丁香酚含量为1.61%，结果稳定。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 专属性考察取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂（乙酸乙酯），按“2.3.3.6” 项下方法分别制备的缺白豆蔻、缺肉豆蔻、缺丁香、缺沉香的阴性样品溶液，按“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果表明丁香酚和桉油精与相邻峰的分离度均大于1.5，阴性溶液对指标成分无干扰，专属性良好，气相色谱图见图2。

图2 各成分GC-MS 色谱图

2.3.4.2 线性关系考察分别吸取不同浓度的对照品溶液（桉油精 0.014、0.036、0.071、0.142、0.355、0.710、1.776、3.552 mg／mL，丁香酚 0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.501、1.251、2.503 mg／mL ），在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归可知桉油精在0.014 ～3.552 mg／mL 内线性回归方程为Y＝374.3X-0.788 2，R2＝0.999 9；丁香酚0.010～2.503 mg／mL 内线性回归方程为Y＝351.22X-1.372 6，R2＝0.999 9，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.4.3 精密度试验取对照品溶液（桉油精1.75 mg／mL，丁香酚1.25 mg／mL）适量，在“2.3.1” 项色谱条件下连续进样测定6 次，测得桉油精、丁香酚峰面积RSD 分别为0.94%、1.00%，表明仪器精密度良好。

2.3.4.4 重复性试验取同一批暖宫7 味挥发性药材6份，按“2.3.3.6” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得桉得油精、丁香酚峰面积RSD 分别为1.00%、0.45%，表明该方法重复性好。

2.3.4.5 稳定性试验按 “2.3.3.6” 项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、18 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得桉油精、丁香酚峰面积RSD 分别为0.94%、1.10%，表明溶液在18 h内稳定性良好。

2.3.4.6 加样回收率试验精密移取各成分含量已知供试品提取液6 份，每份10 mL，置于25 mL 量瓶，均加入10 mg 桉油精对照品和6 mg 丁香酚对照品，用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，桉油精、丁香酚平均加样回收率分别为 101.65%、97.24%，RSD 分别为1.50%、2.97%。