白豆蔻总黄酮的提取及抗氧化活性研究

李利华，郭豫梅

(陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000)

白豆蔻，为芭蕉目姜科豆蔻属植物白豆蔻的果实，可药食兼用。中医认为，白豆蔻性温、味辛，归肺、脾胃经，有温中止呕、化湿行气的功效，常用来治疗湿阻所滞、脾胃不和、脘腹胀满、不思饮食等[1,2]。现代研究表明，白豆蔻中含有挥发油、精油、萜烯类化合物等物质，具有抑菌、平喘、芳香健胃、驱风等多种药理作用[3,4]。

黄酮类化合物是指以C6—C3—C6为基本碳架的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮[5]。黄酮类化合物广泛存在于自然界植物体中，因其有较多的药用功效[6,7]，已成为天然药物的研究热点之一。目前对白豆蔻的研究主要集中在白豆蔻挥发油[8,9]，对于白豆蔻黄酮类化合物的研究较少，仅有朱云霞等利用高速逆流色谱从白豆蔻中分离出5-羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮[10]，而对于白豆蔻总黄酮的提取尚未见报道。本实验以乙醇为溶剂提取白豆蔻中的总黄酮类化合物，通过单因素实验和正交实验设计优化总黄酮的提取工艺条件，并通过对羟基自由基(·OH)的清除及超氧阴离子自由基(O2-·)的清除，考察白豆蔻总黄酮的抗氧化活性，为白豆蔻总黄酮的进一步开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白豆蔻：购于当地药材市场；将白豆蔻洗净，低温烘干，粉碎备用。

芦丁标准品：优级纯；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、双氧水、邻苯三酚等：以上试剂均为国产分析纯。

UV型紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器公司；TDL-9001型光电分析天平 北京梅特勒精密仪器公司；PHS-3C 酸度计 北京赛多利斯仪器有限公司；SHB-III循环水式真空泵 开封宏兴科教仪器厂。

1.2 实验方案

1.2.1 标准曲线的绘制

以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[11]。配制一系列不同浓度梯度的芦丁标准溶液，分别显色后于510 nm处测定吸光度值，得到标准曲线方程：A=5.342C-0.208，R=0.9979，其中C为芦丁浓度(mg/mL)，A为对应的吸光度值。

1.2.2 白豆蔻总黄酮的提取及总黄酮含量的测定

准确称取白豆蔻粉末3.00 g，按照一定的料液比(g/mL)加入提取剂乙醇，设定一定的提取温度和提取时间浸提白豆蔻总黄酮，抽滤，即得白豆蔻总黄酮提取液。

精密吸取定容好的溶液提取2.00 mL于25 mL容量瓶中，按照1.2.1的方法显色后，在510 nm处测定溶液的吸光度，计算白豆蔻总黄酮提取率。

白豆蔻总黄酮提取率(%)=(测得总黄酮浓度×溶液体积×稀释倍数)/干样品质量。

1.2.3 单因素实验

以提取率为衡量指标，分别考察乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、提取温度(40，50，60，70，80 ℃)、提取时间(20，40，60，80，100 min)对白豆蔻总黄酮提取率的影响效果，筛选出各因素的最优水平区间，每个处理做3份平行。

1.2.4 正交实验设计

根据各单因素实验的优选结果，设计四因素三水平的正交实验，利用L9(34)正交实验表优化白豆蔻总黄酮提取工艺，正交实验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 白豆寇总黄酮抗氧化性能实验

参照文献[12,13]的方法并略有改动。以Vc为阳性对照品，考察白豆蔻总黄酮对羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对白豆蔻总黄酮提取率的影响结果

图1 乙醇浓度对提取率的影响Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

由图1可知，乙醇浓度在40%～60%内，白豆蔻总黄酮提取率随乙醇浓度的增加呈上升趋势，当乙醇浓度为60%时提取率最高，为2.41%，而当乙醇浓度高于60%后，白豆蔻总黄酮提取率逐渐下降，这可能是因为乙醇浓度越高，醇溶性杂质、色素及亲脂性强的组分浸出量会增加，导致黄酮类化合物提取率下降。因此，乙醇浓度选择60%左右最佳。

2.1.2 料液比对白豆蔻总黄酮提取率的影响结果

图2 料液比对提取率的影响Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate

由图2可知，料液比在1∶20～1∶40内，随着料液比的增大，白豆蔻总黄酮提取率明显上升，当料液比为1∶40时提取率最高，为2.26%，而当料液比大于1∶40后，白豆蔻总黄酮提取率有所下降。这可能是因为适当增大提取剂用量有利于白豆蔻总黄酮的溶出，但提取剂用量过大，一方面总黄酮的溶出已达饱和，另一方面其他杂质成分的溶出会增多，增加了后续浓缩、分离纯化的负担。因此，料液比选择1∶40左右最佳。

2.1.3 提取温度对白豆蔻总黄酮提取率的影响结果

图3 提取温度对提取率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction rate

由图3可知，提取温度在40～80 ℃范围内，随着温度的升高白豆蔻总黄酮提取率呈先上升后下降的趋势，70 ℃时总黄酮提取率达最大值，为2.38%，当提取温度高于70 ℃时，白豆蔻总黄酮提取率有所下降；这可能是因为过高的温度会引起黄酮分子发生裂解，使得提取率降低。因此，提取温度选择70 ℃左右最佳。

2.1.4 提取时间对白豆蔻总黄酮提取率的影响结果

由图4可知，提取时间在20～60 min范围内，白豆蔻总黄酮提取率随提取时间的延长逐渐增加，且在提取时间60 min时提取率最高，为2.32%，而当提取时间超过60 min后，白豆蔻总黄酮提取率有所下降。可能的原因是长时间受热会使已溶出的黄酮类化合物键断裂，导致总黄酮提取率降低。因此，提取时间选择60 min左右最佳。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 The effect of extraction time on the extraction rate

2.2 正交实验设计结果

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，比较K值大小可得到白豆蔻总黄酮的最优提取条件为A2B1C2D2，即：乙醇浓度60%，料液比1∶30 (g/mL)，提取温度70 ℃，提取时间60 min；由极差R值可得出4个因素对总黄酮提取的影响主次顺序为A(乙醇浓度)>C(提取温度)>D(提取时间)>B(料液比)。

2.3 验证性实验

表3 验证实验结果Table 3 The results of verification experiment

由表3可知，在优化得到的最佳工艺条件下，白豆蔻总黄酮平均提取率为2.82%，高于表2正交实验设计表中的9组提取率结果，RSD<1.65%，表明该工艺条件稳定，可以作为白豆蔻总黄酮的提取工艺条件。

2.4 白豆蔻总黄酮抗氧化活性实验结果

2.4.1 对·OH清除实验结果

图5 白豆蔻总黄酮对·OH的清除作用Fig.5 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against·OH

由图5可知，随着白豆蔻总黄酮提取液浓度的增大，其对·OH的清除率逐渐升高，在实验浓度范围内最大清除率为73.7%；与对照品Vc比较可知，Vc对·OH的最大清除率为90.1%，高于白豆蔻总黄酮，说明白豆蔻总黄酮对·OH具有一定的清除能力，但清除能力低于Vc对照品。

2.4.2 对O2-·清除实验结果

图6 白豆蔻总黄酮对O2-·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against O2-·

由图6可知，随着白豆蔻总黄酮提取液浓度的增大，其对O2-·的清除率逐渐升高，在实验浓度范围内白豆蔻总黄酮对O2-·的最大清除率为87.8%，对照品Vc的最大清除率为90.3%；由此可知，在实验浓度范围内，白豆蔻总黄酮对O2-·的清除能力与Vc相当。

3 结论

本实验以乙醇为溶剂提取白豆蔻中的总黄酮，通过单因素实验和正交实验优化提取工艺；以羟基自由基清除率及超氧阴离子自由基清除率为指标，考察白豆蔻总黄酮的抗氧化性。实验结果表明，白豆蔻总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%，料液比1∶30 (g/mL)，提取温度70 ℃，提取时间60 min，在此工艺条件下，白豆蔻总黄酮提取率为2.82%，说明该优化工艺条件稳定，可以作为白豆蔻总黄酮的提取工艺条件。白豆蔻对羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除实验显示，在实验范围内对·OH的最大清除率为73.7%，对O2-·的最大清除率为90.1%，与Vc对照品比较可知，在实验范围内白豆蔻总黄酮对·OH的清除能力略低于Vc，对O2-·的清除能力与Vc相当，说明白豆蔻总黄酮对·OH和O2-·均具有一定的清除能力。本研究结果可为白豆蔻总黄酮类化合物的工业化生产和进一步开发利用提供一定的理论参考。