金匮肾气丸对阴阳两虚型糖尿病肾病患者的临床疗效

王毅强，越东杰，王俪娟，郭 鑫，张承宇，吴飞飞*

（1.长治医学院附属和平医院，山西 长治 046000； 2.长治医学院，山西 长治 046000）

糖尿病肾脏疾病是糖尿病并发微血管病变引起的慢性肾脏病，是糖尿病最常见、最严重的并发症，在我国近20%的2 型糖尿病患者可能有肾病并发症［1］，目前已经成为慢性肾脏病、终末期肾衰竭的主要病因［2］，传统西医治疗效果有限［3］，并被证实并不能阻碍糖尿病肾脏疾病进展为终末期肾脏病［4］，故积极探寻治疗糖尿病肾脏疾病的新方法及其机制以延缓疾病发生及发展，对提高糖尿病患者存活率、改善其生活质量具有重要意义。

近年来研究表明，肠道菌群失调与糖尿病肾脏疾病发生发展密切相关，前者有害代谢物尿毒症毒素和自身成分通过受损的肠道屏障进入循环，触发氧化应激、炎症反应通路，最终导致肾组织炎症、细胞凋亡、纤维化、肾功能衰退［5］。一些治疗糖尿病肾脏疾病的中药（如肾炎康复片［6］、清热消正方［7］等）在改善糖尿病肾脏疾病症状、临床指标的同时，对肠道菌群产生有益的影响，其中金匮肾气丸可降低糖尿病肾脏疾病患者血糖、血脂、尿蛋白，改善肾功能［8］，可能与抑制氧化应激、降低慢性炎症、保护肾脏足细胞、改善慢性纤维化等机制有关［9］，但它是否能改善糖尿病肾脏疾病患者肠道菌群，以及对糖尿病肾病的保护作用是否与改善肠道菌群有关尚不明确。因此，本研究探讨金匮肾气丸对阴阳两虚型糖尿病肾病患者的临床疗效，以期为效果中西医结合治疗提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2021 年3 月至2021 年11 月收治于长治医学院附属和平医院的20 例阴阳两虚型糖尿病肾脏疾病患者，随机分为对照组和观察组，每组10 例。其中，对照组男性6 例，女性4 例； 年龄44～73 岁，平均年龄（60.60±11.67）岁； 平均收缩压（144.30±19.50）mmHg； 平均舒张压 （87.70±10.11）mmHg； 平均空腹血糖 （11.93±4.29）mmol／L，而观察组男性3 例，女性7 例； 年龄46 ～74 岁，平均年龄（60.40±8.58）岁； 平均收缩压（129.30±11.12）mmHg； 平均舒张压（78.80±13.42）mmHg； 平均空腹血糖（10.21±3.50）mmol ／L，2 组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。研究经医院伦理委员会批准（批号RT2021067）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医（糖尿病肾病）参照《糖尿病肾脏疾病诊疗中国指南》［10］、《中国2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［11］，即典型糖尿病症状，有多饮、多尿、多食、消瘦等症状，空腹血糖≥7.0 mmol／L 或随机血糖≥11.0 mmol／L 或OGTT 2 h ≥11.0 mmol／L 或糖化血红蛋白≥6.5%，同时与尿蛋白、肾功能变化存在因果关系，并排除其他原发性、继发型肾小球疾病及系统性疾病，（1）随机尿白蛋白／肌酐比值（UACR）≥30 mg／g，在3 ～6 个月内重复检测仍≥30 mg／g； （2）估算肾小球滤过率（eGFR）＜60 mL／ （min·1.73 m2），持续3 个月以上； （3）肾活检符合糖尿病肾脏疾病病理改变，符合上述情况之一即可确诊。

1.2.2 中医（阴阳两虚型）参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》［12］，主证精神萎靡，形寒肢冷，大便泄泻，阳痿，遗精； 次证面色苍白无华，倦怠乏力，面目浮肿，腰酸耳鸣； 舌淡，苔白，脉沉迟或沉细无力。具备主证2 项或主证1 项、次证1 项，结合舌脉即可辨证。

1.3 纳入标准 （1）符合 “1.2” 项下诊断标准；（2）Mogensen分期Ⅲ期、Ⅳ期（即临床肾病期），其中Ⅲ期UACR 30～299 mg／g，Ⅳ期ACR＞300 mg／g； （3）年龄30～80 岁，病程6～10 年； （5）可长期随访； （5）患者自愿参加本研究，签署知情同意书。

1.4 排除标准 （1）合并原发性或其他继发性肾脏疾病，如诊断明确的肾小球肾炎、IgA 肾病、高血压肾病；（2）近2 周内使用过可能影响临床结果评价的药物，如抗生素等； （3）近3 个月或目前口服益生元、益生菌等调节肠道菌群的药物； （4）近6 个月内有糖尿病急性并发症或应激状态； （5）近6 个月内有心肌梗死或卒中史，或存在严重心血管疾病及风险、肝功能异常、血液系统疾病、恶性肿瘤； （6）合并泌尿系感染、终末期肾脏病、接受过或正在接受透析治疗； （7）对研究药物有严重禁忌：（8）妊娠期妇女。

1.5 治疗手段 对照组采用常规治疗，包括（1）糖尿病肾病饮食教育； （2）适度运动； （3）药物，如胰岛素或降糖类药物降糖、钙通道阻滞剂类药物降压、他汀类药物调脂。观察组在对照组基础上采用金匮肾气丸［中国北京同仁堂（集团）有限责任公司，水蜜丸，25 粒（5 g）］，每天2 次。2 组疗程均为1 个月。

1.6 指标检测 治疗前，收集一般资料，进行常规生化检查，计算中医证候评分，采集粪便（置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存）。治疗后，计算中医证候评分，检测空腹血糖（FBG）、餐后2 h 血糖（2 hPBG）、甘油三酯（TC）、胆固醇（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血肌酐（SCr）水平及随机尿微量白蛋白／肌酐比值（ACR），采集粪便（置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存）。对粪便进行微生物多样性检测，提取其总基因组DNA，对细菌16S rRNA 的V3V4 区进行PCR扩增测序，采用QIIME、R 包（v3.2.0）、MEGAN 等软件进行分析，比较2 组粪便微生物组成差异。

1.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，不符合者以［M（P25，P75）］表示，组间比较采用t检验（正态分布）或秩和检验（非正态分布）； 计数资料以百分率表示，组间比较采用卡方检验或Fisher 检验。通过QIIME、R 包（v3.2.0）软件计算α、β 多样性，比较2 组肠道菌群差异，双变量相关性研究采用Spearman 相关分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床指标 治疗后，观察组中医证候评分、舒张压及FBG、2 hPBG、TC、LDL 水平降低（P＜0.05），HDL 水平升高（P＜0.05），见表1，并且ACR 中位数降低 （P＜0.05），见表2。治疗后，对照组中医证候评分及FBG、2 hPBG、TC、LDL 水平降低（P＜0.05），HDL 水平升高（P＜0.05），见表3，并且ACR 中位数降低（P＜0.05），见表4。另外，治疗后，2 组中医证候评分、收缩压、舒张压比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 治疗前后观察组正态分布计量资料比较（x±s，n＝10，1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 治疗前后观察组非正态分布计量资料比较［M （P25，P75），n＝10］

表3 治疗前后对照组正态分布计量资料比较（x±s，n＝10，1 mmHg＝0.133 kPa）

表4 治疗前后对照组非正态分布计量资料比较［M （P25，P75），n＝10］

2.2 肠道菌群差异 将粪便分为A 组（观察组治疗前）、B 组（观察组治疗后）、C 组（对照组治疗前）、D 组（对照组治疗后），分别采用ACE、Chao、Shannon、Simpson 指数估计群落的多样性，结果见图1。由此可知，4 组物种丰富度、多样性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 4 组肠道菌群Alpha 多样性指数

beta 多样性采用非度量多维尺度分析（NMDS 分析）观察微生物群落的相似性程度，通过对样本距离进行等级排序来使其在低维空间中的排序尽可能符合彼此之间的距离远近关系，结果见图2。

图2 4 组肠道菌群beta 多样性

Anosim 检验用于检验组间的差异是否显著大于组内差异，结果见图3，可知R＝-0.004＜0，表明组间差异小于组内差异；P＝0.52＞0.05，表明差异无显著性。另外，4 组之间的肠道微生物群落结构不存在显著性差异，表明治疗前后肠道菌群异质性差异较小。

图3 4 组肠道菌群Anosim 检验

LEfSe 分析基于线性判别分析（LDA），可用于找出重要的、组间具有显著差异的物种，本实验采用该方法找出4组中的显著菌属，LDA score 为2，P＜0.05 （Krukal Wallis Anova test、Wilcoxon test），结果见图4，可知B 组f_ _Prevotellaceae.g_ _ Prevotella_ 7 菌增加，表明治疗后肠道菌群中普雷沃氏菌（Prevotella_ 7）相对丰度升高。

图4 LDA 值分布柱状图

通过16s 测序数据进行功能预测，对不同样品、分组之间在功能上的差异进行分析，采用PICRUSt 软件，基于已测细菌16S rDNA 信息并比对Greengenes 数据库后近缘物种的OTU 信息，推断其共同祖先的基因功能谱，同时对Greengenes 数据库中其他未测物种的基因功能谱进行推断，构建古生菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱，最后将测序得到的菌群组成“映射” 到数据库中，对菌群代谢功能进行预测，结果见图5，可知B 组碳水化合物代谢水平升高，P＝0.038＜0.05，即治疗后肠道菌群对碳水化合物代谢功能增强。

图5 A、B 组肠道菌群功能差异预测

2.3 相关性分析 结果见图6，可知BMI 及TC、LDL 水平与Lac_ Tyzzerella_ 3 菌群相对丰度呈正相关，中医证候评分、病程、2 hPBG 水平与Chr_ Christensenellaceae_ R-7_group 菌群相对丰度呈正相关，TC、LDL 水平与Chr_Christensenellaceae_ R-7_ group 菌群相对丰度呈负相关。

图6 肠道菌群与临床特征、指标的聚类热图

3 讨论

金匮肾气丸功效滋阴、温补肾阳、化气行水、补肾泄邪，方中地黄、山药、山茱萸滋阴，补脾肾，固精，肉桂引火归元，附子助火化升肾气，泽泻、茯苓、牡丹皮利水，泄邪，全方阴中求阳，得阳助阴，补中有泻，泻中寓补，泄而不峻，补而不腻，使阴平阳秘，可治肾虚引起的水肿、消渴、小便不利、腰膝酸软、形寒肢冷、精神萎靡、倦怠乏力［13］。本研究发现，治疗1 个月后观察组中医证候改善、血压降低程度优于对照组，与文献［14］报道金匮肾气丸可改善DKD 患者临床症状、降低血压一致； 治疗后，2 组FBG、2 hPBG、TC、LDL、ACR 降低，HDL 升高，但组间无明显差异，可能是因为（1）西医基础治疗掩盖了金匮肾气丸改善糖脂代谢作用； （2）本实验选择组分固定的中药制剂，并不能根据患者个体化情况灵活调整，未体现中医辨证论治的优势； （3）仅测量空腹血糖、餐后2 h 血糖不能反映血糖控制情况，需进行动态血糖检测； （4）本研究样本量小，存在偏倚概率大，但仍以看出金匮肾气丸在改善中医症状、降低血压方面的优势。另外，治疗前后2组肠道菌群的α、β 多样性无明显差异，表明其丰度、多样性、异质性具有极大相似性，可能是因为（1）在当前条件下2 组治疗方案对患者肠道菌群影响小； （2）治疗时间不足； （3）样本量小，存在偏倚概率大，并且观察组肠道Prevotella_ 7 丰度升高。

普氏菌属是厌氧革兰氏阴性细菌，为人类共栖细菌，它对健康有益与否尚存在争议［15］，经短期膳食纤维治疗后，部分健康人血糖、胰岛素水平降低，其肠道内普氏菌属出现富集［16］。菜豆可增加小鼠肠道中普氏菌属丰度，促进碳水化合物发酵产生SCFAs［17］，后者可作为肠上皮细胞的能源，同时具有增强肠上皮屏障、调节肠道免疫系统、抑制炎症和氧化应激作用［18］，从而抑制糖尿病肾脏疾病发生发展。根据KEEG 功能预测，金匮肾气丸干预后肠道菌群碳水化合物代谢功能增强，但本研究并未检测治疗前后肠道SCFAs 变化，无法判断普氏菌属是否升高其水平而对患者产生益处。

Prevotellacopri富集与胰岛素抵抗有关［19］，普氏菌属在我国高血压前期、原发性高血压患者肠道中富集，可能与触发炎症有关［20］，其中Prevotella_ 7 与增加终身心血管疾病风险相关，Tyzzerella、Christensenellaceae_ R-7 在心血管疾病高风险人群中富集［21］。相关性分析发现，BMI、TC、LDL 与Tyzzerella_ 3 菌群的相对丰度呈正相关，说明Tyzzerella_ 3 的富集与肥胖、血脂异常相关，与Tyzzerella在心血管疾病高风险人群中富集有相关性。TC、LDL 与Christensenellaceae_ R-7 菌群相对丰度呈负相关，与Christensenellaceae_ R-7 在心血管疾病高风险人群中富集不一致，Christensenellaceae 属于厚壁菌门，目前被认为是健康肠道特征的5 个类群之一，与BMI、内脏脂肪量、腰围、腰臀比、TC、LDL、TG、糖代谢受损、血压呈负相关，有望作为一种改善人类健康的治疗性益生菌［22］，故本研究认为TC、LDL 与Christensenellaceae_ R-7 存在负相关性是合理的，而中医证候评分、病程、餐后2 h 血糖与后者存在正相关有待商榷。

综上所述，金匮肾气丸可改善阴阳两虚型糖尿病肾脏疾病患者临床症状、血压，增加肠道菌群Prevotella_ 7 丰度，提高肠道菌群对碳水化合物的代谢能力。但由于时间、人力的限制，本研究样本量较小，可能导致偏倚而产生阴性结果，另外由于未考察治疗前后患者肠道菌群代谢产物、炎症因子变化，无法从其他机制方面确定金匮肾气丸对糖尿病肾脏疾病的作用，今后将扩大样本量，并对上述指标进行检测。