桂郁金多糖结构表征及其体外抗氧化活性研究

关 媛，严淑昕，钱少林，王雪盈，陆芽春，李 霞（桂林理工大学，广西 桂林 541000）

郁金是郁金属植物温郁金、姜黄、广西莪术的干燥块根［1］，它及其所含生物活性成分可调控多种凋亡蛋白、炎症因子、酶和非酶抗氧化剂［2］。该植物性寒，归肝、心、肺经，具有活血止痛、行气解郁、癫痫痰闭、利胆退黄等功效［3］，其提取物具有抗炎、抗菌、抗抑郁、抗肿瘤、免疫调节等功能［4］。

机体氧化应激会导致皮肤衰老、免疫功能下降、内分泌紊乱、肠炎等［5-6］风险。桂郁金中富含多糖类成分，具有降血糖［7］、抗脂质过氧化、抗凝血活性［8］，但目前对该类成分分离纯化、结构、活性等方面的研究较少。Xu 等［9］通过水提法得到莪术多糖，能加快糖尿病小鼠的创面收缩，促进皮肤再生。Dong 等［10］从莪术中提取多糖，能提高小鼠抗免疫调节能力，具有抑制肿瘤作用。侯敏娜等［11］以姜黄郁金为原料，研究了它对DPPH、ABTS 自由基的清除能力。本实验从桂郁金中分离得到2 种多糖，初步表征其结构特征，研究其体外抗氧化活性，旨在为开发新型天然抗氧化剂提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 浓硫酸（批号210916，纯度95.0% ～98.0%）、氨基磺酸（批号210205，纯度≥99.5%）、七水合硫酸亚铁（批号161012，纯度99.0% ～101.0%）、磷酸氢二钠（批号180619，纯度≥99.0%）（汕头市西陇科学股份有限公司）； 抗坏血酸［批号J2120100，阿拉丁试剂（上海）有限公司，纯度≥99.0%］； 3，5-二硝基水杨酸（批号RH249811，纯度98%）、铁氰化钾（批号S61033，纯度98%）（上海源叶生物科技有限公司）； 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批号W3008E46572，美国Sigma 公司）； 其他试剂均为分析纯。桂郁金（批号160401，产地广西钦州，广西南宁生源中药饮片责任有限公司），经桂林理工大学副研究员李静鉴定为广西莪术Curcuma Kwangsiensis。

1.2 仪器 SQP 电子天平 （德国 Sartorius 公司）；ALPHA1-2 LD 型冷冻干燥机 （德国Martin Christ 公司）；Nicolet iS 10 型傅里叶红外变换光谱仪（上海亚荣生化仪器厂）； YK722PC 型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）； XD-5210A 型旋转蒸发仪、YJD20D-GL 型十功能自动煎药机（上海贤德实验仪器有限公司）； 98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）； DL-5-B 型大型离心机（上海安亭科学仪器厂）； BT100-2J 型恒流泵（保定兰格恒流泵有限公司）。

2 方法

2.1 多糖制备 参考文献［12-13］报道，将桂郁金与75%乙醇以1 ∶20 比例浸泡过夜，电热套加热5 h 以去除脂溶性杂质。乙醇提取后的药材于通风处晾晒至干燥后，与蒸馏水以1 ∶16 比例在100 ℃下提取3 h，共2 次。旋转蒸发仪浓缩后，加入无水乙醇至终体积分数为60%，静置24 h后4 000 r／min 离心15 min，收集沉淀，蒸馏水溶解，冷冻干燥，得到粗多糖，取2 g 至200 mL 蒸馏水中溶解，得到10 mg／mL溶液，在-20 ℃下冷冻24 h 后4 ℃下解冻，8 000 r／min 离心10 min，取上清，采用DEAE52 柱层析进行分离，蒸馏水洗脱得到中性糖部分WPCK-N，0.7 mol／L NaCl 洗脱得到酸性糖部分WPCK-A。

2.2 理化性质测定 以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量［14］，取1 mL 0.1 g／L 样品溶液至试管中，加入0.5 mL 6%苯酚溶液、2.5 mL 浓硫酸，振荡，沸水浴反应10 min，于490 nm 波长处测定吸光度。以半乳糖醛酸为对照品，采用间羟基联苯法检测糖醛酸含量［15］，在试管中依次加入400 μL 0.1 g／L 样品溶液、40 μL 氨基磺酸、2.5 mL 浓硫酸，振荡摇匀，沸水浴20 min，冷却至室温后加入40 μL 间羟基联苯试剂，室温反应15 min，于525 nm波长处测定吸光度。以牛血清白蛋白（BSA）为对照品，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量［16］，取1 mL 样品溶液，加入1 mL 蒸馏水、1.5 mL DNS，沸水浴5 min，冷却至室温后定容至25 mL，于540 nm 波长处测定吸光度。

2.3 单糖组成分析 以1-苯基3-甲基5-吡唑酮（PMP）进行样品衍生化。称取10 mg 样品，5 mL 3 mmol／L 三氟乙酸在105 ℃下水解6 h，加入100 μL 0.3 mmol／L 氢氧化钠、0.3 mmol／L PMP，在70 ℃下放置1 h，冷却至室温，100 μL 0.3 mmol／L 盐酸中和混合物，氯仿提取3 次，采用HPLC 法对水相进行分析，条件为安捷伦XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相0.05 mmol／L 磷酸盐缓冲液溶液（A，pH＝6.8）-83%乙腈（B），梯度洗脱（0 ～6 min，90% ～85%A； 7～13 min，85% ～80%A； 30～36 min，65% ～60% A； 60 ～67 min，40% ～35% A）； 体积流量1 mL／min； 柱温 30 ℃； 检测波长 254 nm； 进样量10 μL［16］。

2.4 多糖分子量测定 采用高效凝胶渗透色谱仪，凝胶柱选用TSK-gel G-4000PWxl； 洗脱液0.02 mmol／L 磷酸二氢钾溶液； 体积流量0.5 mL／min； 检测器Waters2414 示差折光检测器； 不同分子量葡聚糖（T1000、T500、T70、T40、T10、T5）校准色谱柱； 柱温35 ℃［17-18］。

2.5 红外光谱测定 取1 mg 样品，于玛瑙研钵中与100 mg KBr 混合，在红外烘灯下烘干研磨，取少量粉末在9.81 GPa 压力下压30 s，制成薄片，红外光谱仪在4 000 ～500 cm-1波数范围内进行红外光谱扫描［19］。

2.6 XRD 测定 参考文献［20］报道，采用X 射线粉末衍射仪对样品进行测定，条件设置为管压40 kV； 管流30 mA； 数据采集范围5 ～80°； 步幅0.02°； 计数时间0.78 s／step。

2.7 扫描电镜测定 取样品粉末适量，通过导电胶粘附于扫描电镜样品台上，喷金处理20 s，在扫描电子显微镜下观察外貌形态，放大倍数为1 000，并进行拍照。

2.8 体外抗氧化活性研究 以抗坏血酸为阳性对照，样品浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg／mL，平行3 次。

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 参考文献［21］报道，将50 μL 不同浓度样品溶液与200 μL 0.004%DPPH 溶液（无水甲醇溶解）混合反应，在37 ℃下避光反应1 h，12 000 r／min 离心5 min，于517 nm 波长处测定吸光度A1； 用无水甲醇代替DPPH 溶液，测定吸光度A2； 用蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度A0，计算DPPH 自由基清除率，公式为清除率＝ ［1- （A1-A2）］×100%。

2.8.2 羟基自由基清除能力 参考文献［22-23］报道，将50 μL 样品溶液与100 μL 9 mmol／L 硫酸亚铁、100 μL 9 mmol／L水杨酸（无水乙醇溶解）混合，加入100 μL 过氧化氢（8.8 mmol／L），在25 ℃下反应30 min，12 000 r／min离心5 min，于510 nm 波长处测定吸光度A1； 用蒸馏水代替过氧化氢，测定吸光度A2； 用蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度A0，计算羟基自由基清除率，公式为清除率＝［1- （A1-A2）／A0］×100%。

2.8.3 铁离子还原能力 参考文献［24］报道，将1.0 mL 样品溶液与1.0 mL 1%铁氰化钾溶液混合，在50 ℃下反应20 min，冷却至室温后，加1.0 mL 10% 三氯乙酸，5 000 r／min 离心15 min，取2.5 mL 上清液与0.15 mL 0.1%氯化铁混合，于700 nm 波长处测定吸光度。

3 结果

3.1 多糖组成 表1 显示，WPCK-N 主要由葡萄糖组成，还含有少量甘露糖、半乳糖，而WPCK-A 主要由半乳糖、葡萄糖组成，还含有少量甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖； 两者酸性单糖含量均较低。综上所述，从桂郁金中提取的多糖大多为中性糖。

表1 桂郁金多糖组成分析

3.2 红外光谱 图1 显示，WPCK-N 在3 410 cm-l附近的宽拉伸峰对应于O-H 的拉伸振动，2 920 cm-1附近具有弱C-H拉伸振动的特征吸收，1 400 ～1 000 cm-1分别由O-H、C-H伸缩振动导致，678 cm-1为长链烷烃骨架振动吸收峰，而WPCK-A 的C＝O 吸收峰集中在1 640 cm-1处，主要是羧基的C＝O 吸收峰，峰的强度和尖锐程度可能体现羧基含量；在3 430 cm-1附近的谱带强度为O-H 的伸展频率，此处强度较大； 吸收峰集中于1 120.40 cm-1，在1 600 ～600 cm-1范围内的峰型更清晰集中； 与WPCK-N 相比，WPCK-A 吸收峰主要集中在1 419.06 cm-1处，1 200 ～950 cm-1附近峰归属于C-O-H 变角振动或吡喃糖环中C-O-C 伸缩振动（1 100～1 200 cm-1附近为吡喃糖环上C-O 吸收峰，1 070、1 023 cm-1附近C-O-H 变角振动）。

图1 桂郁金多糖红外光谱图

3.3 扫描电镜 图2 显示，WPCK-N 主要呈片状，而WPCK-A 主要由块状和少许的片状组成，两者表面都比较粗糙。研究表明，中性、酸性多糖外貌形状差异可能和所带电荷不同有关［25］，而WPCK-N 整体上外貌形状比WPCK-A 小，可能与多糖本身性质有关。

图2 桂郁金多糖扫描电镜图（HE，×1 000）

3.4 XRD 分析 图3 显示，2 种多糖的最高峰都出现在20°左右，WPCK-N 在21.32°处有1 个较为宽的衍射峰，而WPCK-A 在20.29°处有1 个不明显的包峰，其他范围只有少数弱衍射峰存在，并且两者均为无定形结构。

图3 桂郁金多糖XRD 图

3.5 体外抗氧化活性研究

3.5.1 DPPH 自由基清除能力 图4 显示，在0 ～3.2 mg／mL质量浓度范围内2 种多糖均具有DPPH 自由基清除能力，并呈剂量依赖性，但均小于抗坏血酸； 为3.2 mg／mL时清除作用最强，清除率分别为56.78%、32.22%，以WPCK-N 更明显。另外，相比绵麦冬中性糖［26］、北五味子中性糖［27］、人参果［28］等植物中性糖，WPCK-N 的DPPH自由基清除能力较强。

3.5.2 羟基自由基清除能力 图5 显示，在0～3.2 mg／mL质量浓度范围内，2 种多糖对羟基自由基的清除率逐步上升，并具有剂量依赖性； 为0.8 mg／mL 后增长程度趋于平缓； WPCK-A 质量浓度为3.2 mg／mL 时清除作用最强，清除率达23.45%。Chaiwong 等［29］证实，低分子量多糖呈现出较好的羟基自由基清除率，而WPCK-N 分子量较高，为2.88×105Da，WPCK-A 分子量仅为1.39×105Da，故推测可能是后者效果更好的原因。

图5 桂郁金多糖对羟基自由基的清除能力

3.5.3 铁离子还原能力 刘宏等［30］报道，还原能力与多糖体外抗氧化能力有一定联系，多糖还原性的吸光度越高，其抗氧化能力越强。图6 显示，随着铁离子浓度升高，抗坏血酸总还原能力变化不大，但总体仍呈上升趋势； 2 种多糖的还原能力随着其质量浓度升高而逐渐增加，以WPCK-N更明显。综上所述，桂郁金多糖具有将Fe3＋还原成Fe2＋的能力，从而增强其体外抗氧化活性。

图6 桂郁金多糖铁离子还原能力

4 讨论

倪力军［31］、Chaiwong 等［29］研究表明，多糖单糖组成、含量、分子量会影响其体外抗氧化活性，含有葡萄糖的多糖抗氧化活性明显高于不含葡萄糖者。实验结果显示，WPCK-N 的DPPH 自由基清除能力及铁离子还原能力比WPCK-A 更明显，推测可能与葡萄糖含量差异有关（WPCK-N 为98.3%，WPCK-A 为21.4%），但羟基自由基清除作用恰好相反，低分子量的WPCK-A 呈现出较好的清除能。前期报道，中性糖、酸性糖存在活性差异，胡彦波［32］对薇菜多糖进行分离纯化，发现中性糖DPPH 清除率、还原能力均高于酸性糖，但羟基自由基抗氧化能力略弱于后者，与本实验结果一致。黄妮等［26］发现，绵麦冬多糖有较强的抗氧化活性，其中性糖的DPPH 自由基清除活性低于酸性糖，羟基自由基活性更高。程丽敏等［33］以金花葵茎可溶性糖为研究对象，发现其酸性糖抗氧化活性强于中性糖，该差异可能与多糖本身性质有关。

本实验以热水提取、乙醇沉淀的方法提取得到粗多糖，再利用DEAE-52 纤维素分离得到桂郁金中的中性多糖（WPCK-N）和酸性多糖 （WPCK-A）。对 WPCK-N 和WPCK-A 进行了理化性质检测和体外抗氧化分析。结果显示WPCK-N 主要由葡萄糖组成，WPCK-A 主要由半乳糖、葡萄糖组成，半乳糖醛酸和葡糖糖醛酸的所占比例较低，与红外光谱分析结果一致。扫描电镜进一步显示，WPCK-N主要是片状，WPCK-A 主要是块状和少许的片状。体外抗氧化结果表明，桂郁金多糖具有清除自由基（DPPH 和羟基自由基）的能力和良好的还原能力，且呈浓度依赖性。其中WPCK-N 的DPPH 自由基清除能力较强，质量浓度为3.2 mg／mL 时，清除率最高，达到56.78%。WPCK-A 在质量浓度为3.2 mg／mL 的羟基自由基清除率最高为23.45%。WPCK-N 的总还原能力较WPCK-A 明显。上述结果表明，桂郁金多糖有较好的抗氧化活性，具有开发为新型天然抗氧化剂及功能性食品的潜力，并为今后相关研究提供参考思路。