低氧预处理hUCMSC-Exos通过抑制肺血管EndMT缓解低氧性肺动脉高压*

王玉香，刘川川，张晴晴，黄 攀，刘 红，马有刚，王小波，王亚婷，马 兰△

（1青海大学医学部，青海 西宁 810016；2青海大学附属医院包虫病实验室，青海 西宁 810001；3青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001）

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是由于肺血管收缩和血管重构所致的肺动脉压力持续增高，导致右心肥厚甚至衰竭［1］。肺血管重构是HPH 发生发展的关键环节，表现为肺动脉平滑肌细胞过度增殖、肺动脉内皮细胞功能障碍和肺血管纤维化［2］。内皮细胞功能障碍是肺血管重构的关键因素［3］。内皮细胞发生不可逆增殖，失去其内皮表型转化为间充质样表型，即发生内皮-间充质转化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）。EndMT 可导致细胞外基质合成增多、降解减少，引起血管纤维化，促进HPH 的形成。阻断HPH 病理改变的多个环节，才能有效阻止或逆转疾病的进展，因此调节EndMT可能是一项新的治疗方式。

随着再生医学的发展，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）具有免疫原性低和多向分化能力等优势，展示出良好的治疗潜力。然而，有研究表明移植后的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）主要通过旁分泌起作用，其分泌的外泌体（exosomes，Exos）具有源细胞的生物学活性且易于存储［4］，成为无细胞疗法的研究热点。Exos 是由MSCs 分泌的直径为30～200 nm 的具有双层脂质膜包裹的囊泡，可携带源细胞的蛋白质、DNA 和RNA 等而进行物质交换和信息传递［5］。hUCMSC-Exos 在组织修复、抗炎和免疫调节中发挥重要作用［6］。

有研究报道，经低氧预处理后hUCMSCs 活力增强，促进其Exos 的释放［7］；且低氧预处理MSCs 释放的Exos 比常氧Exos 更能减少炎症细胞浸润［8］。目前，低氧预处理hUCMSC-Exos 对HPH 肺血管EndMT的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探讨低氧预处理hUCMSC-Exos对HPH肺血管EndMT的影响。

材 料 和 方 法

1 实验动物与细胞

人脐带组织均来源于青海大学附属医院产科健康产妇的新生儿，经产妇和家属签订知情同意书后采集。本课题已通过青海大学医学院伦理委员会的批准（No. Y2022-99）。4～5 周龄SPF 级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24 只，体质量125～150 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证号为No.110011230104604254）。人肺小动脉内皮细胞（human pulmonary arteriole endothelial cells，HPAECs）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

2 主要试剂和仪器

DMEM/F12 培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；ECM培养液和内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS）购自ScienCell；Matrix-GelTM基质胶购自碧云天生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒和VE-cadherin 抗体购自Thermo Scientific；β-actin 抗体购自Abclonal；CD31、vimentin 和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体购自Abcam。JEM-1400FLASH 透射电镜购自JEOL；LSM880共聚焦显微镜和AxioVert. A1 倒置生物显微镜购自Zeiss；Amersham Imager 600 超灵敏多功能成像仪购自GE。

3 实验方法

3.1 hUCMSCs 的分离和培养 无菌状态下收集长约6～8 cm 的脐带组织。在超净台中用无菌PBS溶液冲洗脐带残留血液4～5 次，并剔除脐动脉、静脉。分离华通胶并剪成3 mm×3 mm×3 mm 大小的块状，用组织块贴壁法将组织块贴在洁净的培养皿上，37 ℃培养箱中静置30 min 后加入含20% FBS 的DMEM/F12 培养液。每5 d 更换1 次培养液，待组织块周围爬出细胞且融合度达90%时，用0.125%胰蛋白酶消化成单个细胞并加入DMEM/F12 培养液重悬细胞于培养瓶中，取第2～6代细胞用于后续实验。

3.2 hUCMSCs 免疫表型及分化能力的鉴定 将第2 代hUCMSCs 用0.125%胰蛋白酶消化离心后加入CD34、CD45、CD29、CD90 和CD44 抗体孵育，用流式细胞仪检测以上表面标志物的表达。参考文献方法［7］，成脂成骨诱导分化液培养21 d后用油红O和茜素红S染液检测hUCMSCs成脂和成骨分化能力。

3.3 hUCMSC-Exos 的提取、鉴定与共培养 待hUCMSCs 融合度达到80%时更换为无血清DMEM/F12 培养液，置于CO2培养箱（5% CO2+21% O2+74% N2）或三气培养箱（5% CO2+1% O2+94% N2）培养48 h后，收集常氧或低氧培养液。参考文献方法［9］用超滤法提取hUCMSC-Exos。取10 μL hUCMSC-Exos 滴加于2 mm 的铜网上，室温孵育1 min 后用3%醋酸双氧铀孵染3 min，室温晾干后在透射电镜下观察并拍照。采用纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技术检测hUCMSC-Exos 粒径；采用Western blot法检测hUCMSC-Exos表面标志蛋白CD9、Alix 和Tsg101 表达水平。用PKH26 标记hUCMSCExos，与HPAECs 在37 ℃、5% CO2培养箱中共培养24 h，激光共聚焦显微镜下观察HPAECs对hUCMSCExos的摄取情况并拍照。

3.4 动物分组及模型的建立 用随机数字法将SD大鼠随机分为常氧（normaxia，N）组、低氧（hypoxia，H）组、低氧+常氧hUCMSC-Exos（H-NExo）组和低氧+低氧预处理hUCMSC-Exos（H-HExo）组，每组6 只。将N组大鼠置于常氧环境（21% O2），后3组大鼠置于模拟海拔5 000 m 的低压氧舱（10% O2），每组大鼠均可自由进食水。后3组大鼠在低氧第3、5、7、10和14天时经尾静脉分别注射200 μg 常氧hUCMSC-Exos、低氧预处理hUCMSC-Exos 或等体积PBS。21 d 后检测各组大鼠相关指标的变化。

3.5 实验动物相关指标检测

3.5.1 右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）检测 各组大鼠经3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰卧位固定，参考文献方法［10］分离大鼠右侧颈外静脉，将PE-50 导管经右侧颈外静脉缓慢插入大鼠右心室后得到稳定的波形，记录RVSP。

3.5.2 右心室肥厚指数（right ventricular hypertrophy index，RVHI）检测与肺动脉分离 大鼠颈椎脱臼后剪开胸腔取出心肺组织，分离心脏去除左右心耳，沿室间隔剪下右心室，吸干水分后分别称量右心室（right ventricle，RV）及左心室加室间隔（left ventricular plus septum，LV+S）的重量（weight，W），计算RVHI，RVHI=WRV/WLV+S。将新鲜肺组织取出用PBS冲洗残留血液，固定在泡沫板上并浸泡在预冷的PBS中，沿肺动脉主干向下逐级分离肺动脉。PBS洗净肺动脉残留血液后保存在-80 ℃用于后续实验。

3.5.3 肺组织病理学检测 取各组大鼠右下肺叶固定于4%多聚甲醛中，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后制成4 μm 切片。切片经HE 染色后在光学显微镜下观察肺血管病理改变，用Image-Pro Plus 6.0 软件计算分析血管壁面积占血管总面积的百分率（percentage of vascular wall area，WA%）和血管壁厚度占血管外径的百分率（percentage of vascular wall thickness，WT%）。

3.6 HPAECs 培养及分组 HPAECs 用含5% FBS和1% ECGS 的ECM 培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取第2～4 代细胞用于后续实验。HPAECs长至60%时，用无血清ECM 培养液饥饿处理12 h 后随机分为常氧对照（N-Con）组、低氧模型（H-Con）组、低氧+常氧hUCMSC-Exos（Hy-NExo）组和低氧+低氧预处理hUCMSC-Exos（Hy-HExo）组。N-Con 组细胞置于CO2培养箱（5% CO2+21% O2+74% N2），其余3组细胞置于三气培养箱（5% CO2+1% O2+94% N2）并加100 mg/L（此浓度源于之前的研究［12］）常氧hUCMSCExos、低氧预处理hUCMSC-Exos 或等体积PBS，培养48 h进行后续实验［11］。

3.7 细胞相关指标检测

3.7.1 免疫荧光染色 用0.125%胰蛋白酶消化对数生长期HPAECs，接种2×104个细胞于共聚焦培养皿中。将各组干预后的细胞用4%多聚甲醛固定20 min，0.1% Triton X-100 室 温 通 透10 min 后 加 入CD31、VE-cadherin和α-SMA抗体（1：100）4 ℃孵育过夜。次日PBS 洗涤后加入Cy3 标记的山羊抗兔及FITC 标记的山羊抗小鼠荧光Ⅱ抗（1∶300）室温避光孵育1 h。PBS 洗涤后加入DAPI 室温避光染细胞核10 min。在激光共聚焦显微镜下观察并拍照，并用ImageJ软件计算荧光强度。

3.7.2 Transwell 实验 将各组HPAECs 消化离心后用无血清ECM培养液重悬，将1×104个细胞接种于Transwell 上室，下室中加入600 μL ECM 培养液。培养12 h后弃去上室和下室培养液，加入4%多聚甲醛室温固定20 min。用1%结晶紫室温染色20 min，PBS 洗涤后在显微镜下观察并拍照，用ImageJ 软件分析细胞迁移数。

3.7.3 小管形成实验 基质胶用ECM 培养液按1∶3 稀释后取100 μL 加入48 孔板将各组HPAECs 消化离心后用无血清ECM培养液重悬，按每孔1×104个细胞接种于铺有基质胶的48 孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育6 h。显微镜下拍照，用ImageJ 软件分析小管总分支长度。

3.8 Western blot 实验 将各组大鼠肺动脉和消化离心后的HPAECs 中加入RIPA 裂解液，研磨后于冰上静置15 min，4 ℃、13 200×g离心10 min 后取上清。BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度，加入5× Loading Buffer 并调整为等浓度等体积的蛋白样品后99 ℃煮10 min；将蛋白样品在10% SDS-PAGE 凝胶上电泳；再将凝胶上的蛋白转移至PVDF 膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入CD31、VE-cadherin、α-SMA 和vimentin抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（1∶5 000）孵育1 h；用ECL超敏发光液在超灵敏多功能成像仪下对蛋白条带显影；用ImageJ软件分析条带灰度值。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0 软件进行分析。数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 hUCMSCs形态及鉴定

组织块贴壁法培养脐带组织14～21 d后，镜下观察到组织块周围有大量成纤维细胞样细胞爬出（图1A）；经传代后细胞呈长梭形，旋涡状生长（图1B）。茜素红S和油红O染色结果显示，成骨和成脂诱导分化21 d后出现钙化和脂肪滴（图1C）。流式细胞术检测结果显示，hUCMSCs 高表达CD29、CD44 和CD90，不表达CD34和CD45（图1D）。

Figure 1. Morphology and characterization of hUCMSCs. A： spindle-shaped of cells growing from the tissue mass after 21 d of culture（scale bar=100 μm）； B： representative image showing the fibroblast-like morphology of cultured hUCMSCs （scale bar=100 μm）； C： differentiation potential of hUCMSCs observed by alizarin red S and oil red O staining （white arrows indicate the calcium mineralization，while red arrows indicate the fat drops； scale bar=100 μm）； D： surface markers of hUCMSCs analyazed by flow cytometry （positive for CD29，CD44 and CD90，but negative for CD34 and CD45）.图1 hUCMSCs形态及鉴定

2 hUCMSC-Exos形态及鉴定

透射电镜观察到hUCMSC-Exos 呈杯状、圆形囊泡状，外周可见双层膜结构，中央含低密度成分（图2A）。NTA 结果显示，hUCMSC-Exos 直径在30～200 nm 之间（图2B）。Western blot 结果显示，hUCMSCExos 表达CD9、Alix 和Tsg101，而hUCMSCs 不表达以上蛋白（图2C）。

Figure 2. Morphology and characterization of hUCMSC-Exos. A： morphology of hUCMSC-Exos was assessed by transmission electron microscopy （scale bar=100 nm）； B： particle size of hUCMSC-Exos was assessed by nanoparticle tracking analysis； C： the expression of CD9，Tsg101 and Alix was detected by Western blot.图2 hUCMSC-Exos形态及鉴定

3 HPAECs摄取hUCMSC-Exos情况

经激光共聚焦显微镜观察hUCMSC-Exos 在HPAECs 中的归巢现象，结果显示PKH26 标记的hUCMSC-Exos可以被HPAECs成功摄取（图3）。

Figure 3. Uptake of hUCMSC-Exos by HPAECs was observed by immunofluorescence staining （scale bar=20 μm）.图3 HPAECs摄取hUCMSC-Exos

4 低氧预处理hUCMSC-Exos 对大鼠RVSP 和RVHI的影响

与N 组相比，H 组大鼠RVSP 和RVHI 均显著升高（P＜0.01）；与H 组相比，H-NExo 组和H-HExo 组大鼠RVSP 均下降（P＜0.01），且H-HExo 组比H-NExo组大鼠RVSP 下降更显著（P＜0.01），常氧或低氧预处理hUCMSC-Exos 干预后大鼠RVHI 显著降低（P＜0.05），但H-HExo 组与H-NExo 组间相比RVHI 无显著差异（P＞0.05），见图4。

Figure 4. Effects of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo）on right ventricular systolic pressure （RVSP； A） and right ventricular hypertrophy index （RVHI； B） of the rats. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs normoxia （N） group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs hypoxia （H） group； △△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （H-NExo） group.图4 低氧预处理hUCMSC-Exos 对大鼠RVSP 和RVHI 的影响

5 低氧预处理hUCMSC-Exos 对大鼠肺血管重构的影响

HE染色结果显示，与N组相比，H组大鼠肺血管管壁显著增厚，WA%和WT%显著升高（P＜0.01）；与H 组相比，加入常氧或低氧预处理hUCMSC-Exos 后WA%和WT%显著降低（P＜0.01）；与H-NExo 组相比，H-HExo 组WA%和WT%显著降低（P＜0.01），见图5。

Figure 5. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSCs-Exos （HExo） on pulmonary vascular remodeling in rats. A： representative histopathological images of rat pulmonary vessels with HE staining （the upper scale bar=40 μm； the lower scale bar=20 μm）；B： comparsion of percentage of vascular wall area （WA%） in each group； C： comparsion of percentage of vascular wall thickness （WT%） in each group. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs normoxia （N） group； ##P＜0.01 vs hypoxia （H） group； △△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （H-NExo） group.图5 低氧预处理hUCMSC-Exos对大鼠肺血管重构的影响

6 低氧预处理hUCMSC-Exos 对大鼠肺血管End-MT蛋白水平的影响

Western blot 结果显示，与N 组相比，H 组α-SMA和vimentin 表达水平显著升高，CD31 和VE-cadherin表达水平显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与H 组相比，H-NExo 组EndMT 相关蛋白水平无显著差异（P＞0.05）；与H-NExo 组相比，H-HExo 组CD31 和VEcadherin 表达水平显著升高，α-SMA 和vimentin 表达水平显著降低（P＜0.05），见图6。

Figure 6. Effects of hypoxia-preconditioned hUCMSCs-Exos （HExo） on the protein expression levels of CD31，VE-cadherin，α-smooth muscle actin （α-SMA） and vimentin in rat pulmonary vessels were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia （N） group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs hypoxia （H） group； △P＜0.05 vs hypoxia+normoxic hUCMSCExos （H-NExo） group.图6 低氧预处理hUCMSC-Exos对大鼠肺血管中CD31、VE-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平的影响

7 HPAECs形态及鉴定

倒置显微镜下观察，HPAECs呈鹅卵石样生长，分布规则，见图7A。免疫荧光染色结果显示，HPAECs高表达CD31 和VE-cadherin，几乎不表达α-SMA，见图7B。

8 低氧预处理hUCMSC-Exos 对HPAECs 迁移的影响

Transwell 实验结果显示，与N-Con 组相比，HCon 组HPAECs 发生迁移，且迁移数显著增多（P＜0.01）；常氧或低氧预处理hUCMSC-Exos可显著抑制HPAECs 迁移（P＜0.01）；与Hy-NExo 组相比，Hy-HExo组细胞迁移数显著减少（P＜0.05），见图8。

Figure 8. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo） on migration ability of human pulmonary arteriole endothelial cells（HPAECs） was detected by Transwell assay （crystal violet staining，scale bar=50 μm）. Red arrows indicate migratory cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control（N-Con） group； ##P＜0.01 vs hypoxic control（H-Con） group； △P＜0.05 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.图8 低氧预处理hUCMSC-Exos对HPAECs迁移能力的影响

9 低氧预处理hUCMSC-Exos 对HPAECs 小管形成的影响

小管形成实验结果显示，与N-Con 组相比，HCon 组HPAECs 小管形成能力增强，总分支长度显著增加（P＜0.01）；与H-Con 组相比，加入常氧或低氧预处理hUCMSC-Exos 后HPAECs 小管形成减少，总分支长度显著缩短（P＜0.01），且Hy-HExo 组比Hy-NExo 组小管总分支长度显著缩短（P＜0.05），见图9。

Figure 9. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos（HExo） on tube formation of human pulmonary arteriole endothelial cells（HPAECs） was observed by Matrigel tube formation assay （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control （N-Con） group； ##P＜0.01 vs hypoxic control （H-Con） group； △P＜0.05 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.图9 低氧预处理hUCMSC-Exos对HPAECs小管形成的影响

10 低氧预处理hUCMSC-Exos对HPAECs中End-MT的影响

免疫荧光双染（图10）和Western blot（图11）结果显示，与N-Con 组相比，H-Con 组内皮细胞标志物CD31荧光强度显著减弱，间充质标志物α-SMA 荧光强度显著增强（P＜0.01），内皮细胞标志物CD31 和VE-cadherin 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），间充质标志物α-SMA 和vimentin 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与H-Con 组相比，Hy-NExo 组CD31 荧光强度显著增强，α-SMA荧光强度显著减弱（P＜0.01），CD31 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），VE-cadherin、α-SMA 和vimentin 蛋白表达水平无显著差异（P＞0.05）；与Hy-NExo 组相比，Hy-HExo 组CD31 荧光强度显著增强（P＜0.05），α-SMA 荧光强度显著减弱（P＜0.01），α-SMA（P＜0.05）和vimentin（P＜0.01）蛋白表达水平显著降低，CD31和VE-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。

Figure 10. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo） on endothelial-mesenchymal transition in human pulmonary arteriole endothelial cells （HPAECs）. The expression of CD31 and α-smooth muscle actin （α-SMA） in HPAECs was observed by double immunofluorescence staining （green： CD31； red： α-SMA； blue： DAPI； scale bar=50 μm； zoom in：the Merged local magnification，scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control （N-Con） group； ##P＜0.01 vs hypoxic control （H-Con） group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.图10 低氧预处理hUCMSC-Exos对HPAECs内皮-间充质转化的影响

Figure 11. Effects of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo） on the protein expression levels of CD31，VE-cadherin，α-smooth muscle actin （α-SMA） and vimentin in human pulmonary arteriole endothelial cells （HPAECs） were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control （N-Con） group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs hypoxic control （H-Con）group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.图11 低氧预处理hUCMSC-Exos对HPAECs中CD31、VE-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平的影响

讨 论

HPH 是一种以持续的肺血管阻力升高和肺血管重构为特征的进行性疾病［13］。脉血管阻力升高是肺动脉高压的特征，肺血管重构是肺动脉高压的病理标志［14］。尽管越来越多的证据表明药物治疗可以提高HPH 患者的生存率，但仍无法治愈。因此，迫切需要真正逆转HPH血管重塑的新策略。

hUCMSCs 由于具有易获取、较快的自我更新能力和较高的增殖能力等优点［15］，被认为是再生医学中最具潜力的种子细胞之一。研究表明，移植后的MSCs 存在存活率及分化归巢率低等问题，而其可能是通过旁分泌Exos 来发挥作用［16］。Exos 是由MSCs通过胞吐作用释放的细胞外囊泡，具有与源细胞相似的功能，是细胞间通信、代谢和免疫调节的重要载体［17］。氧浓度在MSCs的自我更新、分化和旁分泌功能中发挥重要作用。细胞在体外培养时相对氧含量为21%，而大多数MSCs 存在于体内氧含量2%～8%的环境中［18］，且低氧预处理MSCs来源的Exos更能减少炎症因子的表达，抑制炎症免疫反应［19］。因此，低氧预处理hUCMSC-Exos 可能是治疗HPH 的更好选择。

本研究中，首先成功分离出原代hUCMSCs，用流式细胞术鉴定hUCMSCs 免疫表型，通过成脂成骨诱导分化验证hUCMSCs 具有多向分化能力。通过超滤法成功提取hUCMSC-Exos，分别从动物和细胞水平验证低氧预处理hUCMSC-Exos对低氧诱导的肺血管和HPAECs 中EndMT 的影响。将大鼠于模拟海拔5 000 m的低压氧舱（10% O2）中饲养21 d，RVSP显著升高，右心室肥厚，肺动脉内侧壁增厚及管腔狭窄闭塞，提示HPH 大鼠模型建立成功；经低氧预处理hUCMSC-Exos 干预后可显著降低大鼠RVSP，缓解右心室肥厚程度，逆转肺血管重塑。以上结果提示低氧预处理hUCMSC-Exos 可缓解HPH，抑制肺血管重塑。

在HPH 发展过程中，HPAECs 发生EndMT 是肺血管重塑中关键的一个环节［20］。低氧可诱导多种细胞因子表达激活内皮细胞，通过EndMT 过程将其转化为间充质样细胞，导致内皮细胞功能障碍［21］。内皮细胞发生EndMT 时，内皮细胞标志物如CD31 和VE-cadherin 丢失，间充质样细胞标志物如α-SMA 和vimentin 表达增加，导致细胞连接松散向内膜下迁移，获得增殖和迁移的能力［22］。动物水平研究结果显示，HPH 大鼠模型中肺血管CD31 和VE-cadherin表达下降，α-SMA 和vimentin 表达增多，提示肺血管发生EndMT。在细胞水平上验证低氧（1% O2）可诱导HPAECs发生EndMT，同时HPAECs迁移和小管形成增加。低氧预处理hUCMSC-Exos干预后可部分上调肺血管和HPAECs中CD31和VE-cadherin 的表达，下调α-SMA 和vimentin 的表达，抑制内皮细胞发生EndMT，进而抑制肺血管重塑。

本研究结果表明，低氧预处理hUCMSC-Exos 可抑制肺血管发生EndMT，但其作用机制尚未证实，其可能与miRNA 调控有关。有研究表明低氧预处理hUCMSC-Exos 富集miR-126，可识别并结合HIF-1α启动子序列中的缺氧反应元件，调控HIF-1α 的表达［23］。也有文献报道，miR-146a-5p 在低氧预处理的MSCs的细胞外囊泡中含量相对丰富［24］。

综上所述，低氧预处理hUCMSC-Exos 可以通过抑制EndMT过程，保持肺血管内皮细胞的功能，进而减轻肺血管重塑。因此，低氧预处理hUCMSC-Exos可能是一种潜在治疗HPH 的方式，然而其作用机制还需进一步探索。