飞龙掌血通过调控大鼠M1/M2型小胶质细胞极化减轻脑缺血再灌注损伤*

高建红，王 刚，杨 丹，赵方毓，何一多，陈显兵

（风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北省肾脏病临床医学研究中心，湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000）

缺血性脑卒中是一种急性脑血管疾病，其特征是大脑局部血流突然中断。现阶段，治疗缺血性脑卒中的方法主要包括溶栓和血栓清除，但治疗窗口较狭窄，脑血液循环的恢复会进一步导致脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI），加重神经功能的缺损［1-3］。小胶质细胞（microglia）是脑内巨噬细胞类型之一，是免疫系统的第一道防线，维持脑神经细胞的内环境稳态。机体损伤后，小胶质细胞被激活，M1 型小胶质细胞释放炎症因子，介导神经炎症的发生；而M2型小胶质细胞释放抑炎因子，减轻炎症反应。通过抑制M1型小胶质细胞和促进M2型小胶质细胞的极化，可以减轻炎症［4-5］。因此调控M1/M2型小胶质细胞的极化平衡对于减轻CIRI具有重要意义。

飞龙掌血（Toddaliaasiatica，TA）又名三百棒，为芸香科植物的根，是一种天然药物，也是具有地区的民族特色药。现代药理表明，TA 具有重要的拮抗炎症作用［6-7］。但是，TA 能否通过调控M1/M2型极化来减轻炎症反应，尚未得到系统的研究。因此，本研究通过制备大鼠CIRI模型，探究TA对小胶质细胞中M1/M2 表型极化的影响，深入探讨Toll 样受体介导的神经炎症，以期为TA 减轻CIRI 的作用机理提供依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

80 只2 月龄（体重约200～250 g）的SPF 级雄性SD 大鼠，饲养于清洁级动物房，保持相对湿度在55%、温度在24 ℃，由辽宁省实验动物中心提供，合格证号为SCXK（辽）2020-0001。

2 主要试剂与仪器

主要试剂：尼氏染色液、SDS-PAGE 快速配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；TUNEL 细胞凋亡试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物技术有限公司；Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗体、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗体、核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB） p65 抗体、p-NF-κB p65 抗体、NF-κB 抑制因子（NF-κB inhibitory factor，IκB）抗体、p-IκB 抗体、离子钙结合衔接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）抗体、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）抗体和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗体购自上海Abmart 医药科技有限公司；IL-4 和IL-10 抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；β-actin 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

主要仪器：Tanon-5200 全自动化学发光成像系统购自上海天能科技有限公司、Western blot 电泳装置购自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 药物配制 TA 购自湖北民族大学附属民大医院中药房，经中药实验室专家鉴定为芸香科植物TA的干燥根茎。取飞龙掌血适量，打粉，70%乙醇超声提取，旋转蒸发仪浓缩药液并真空干燥，得TA 醇提物，称重计算收得率为15%，使用时配制成所需浓度。据记载TA 生药成人内服的剂量为：9～15 g/d，取剂量12 g/d。根据实验动物与人体体表面积比例进行计量换算，最终换算为TA 1.08 g·kg-1·d-1。盐酸多奈哌齐片的成人用量为5 mg/d，换算得大鼠剂量为0.45 mg·kg-1·d-1。

3.2 动物分组及造模 基于课题组前期研究［8］造模组选用线栓法行大脑中动脉栓塞术制备CIRI大鼠模型。具体操作：手术前所有大鼠禁食不禁水，麻醉，颈部备皮、消毒，逐层分离左侧皮肤、皮下组织、颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎翼腭动脉。将鱼线栓（长为5 cm、直径为0.4 mm）插入颈总动脉，后经颈内动脉到达大脑中动脉前端。从颈内动脉、颈外动脉Y 型交叉口计算，保证插入18.5 mm。2 h后将线栓拔出，线栓头部到颈内动脉为宜。行为学评分1～3 分表明大鼠造模成功，随机分为模型（model）组、飞龙掌血（TA）组和盐酸多奈哌齐（donepezil，DON）组，并增设假手术（sham）组（仅分离血管），每组16 只。再灌注24 h 后，各组予以对应药物灌胃，分为两个时间段取材：（1）给药7 d，每组6 只大鼠，3只用于病理学观察，3只用于免疫组化检测；（2）给药14 d，每组10 只大鼠，3 只用于病理学观察，3 只用于免疫组化检测，4只用于蛋白含量测定。

3.3 动物一般情况观察 术后观察各组大鼠的基本情况。

3.4 大鼠神经功能评分 造模后，对1、3、7 和14 d的大鼠进行神经功能缺损评分。

3.5 HE、Nissl 和TUNEL 染色 分别给药7 和14 d后，各组随机取3 只大鼠。麻醉，依次进行生理盐水灌注、多聚甲醛灌注，取材后脑组织进行多聚甲醛24 h固定、脱水、石蜡包埋、4 μm 切片，分别进行HE、Nissl和TUNEL染色。

3.6 免疫组织化学法检测Iba1、Arg1 和TLR4 阳性细胞表达情况 分别给药7、14 d 后，各组随机取3只大鼠。麻醉，依次进行生理盐水灌注、多聚甲醛灌注，取材后脑组织进行多聚甲醛24 h 固定、脱水、包埋、4 μm 切片，烤片过夜，二甲苯、无水乙醇梯度脱蜡、水化。柠檬酸抗原修复20 min，PBS 清洗3 min、3次。根据试剂盒说明书，滴加试剂1 和试剂2，滴加I抗Iba1抗体、Arg1抗体、TLR4抗体（比例均为1∶300）静置1.5 h，PBS 清洗3 min、3 次，然后滴加试剂3 静置15 min，PBS 清洗3 min 3 次，滴加试剂4 静置20 min，滴加DAB 显色液避光静置3 min，纯水洗涤后苏木精复染1 min，纯水洗涤1 min，醋酸15 s，纯水洗涤1 min，碳酸锂15 s，纯水洗涤1 min，无水乙醇2 min，二甲苯透明化处理2 min，中性树胶固定。

3.7 Western blot 检测相关蛋白含量的表达 给药14 d 后，每组取4 只大鼠。麻醉，取海马置于-80 ℃冰箱备用；称取20 mg组织放入EP管中，加入200 μL裂解混合液，裂解液与PMSF 比例100∶1，依次进行剪碎、研磨、超声、裂解、离心、取上清液、配平每组蛋白，再依次配制凝胶、电泳、转膜、封闭，随后加入抗体TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB、IL-6、Arg1（比例均为1∶1 000），IL-4、IL-10、Iba1（比例均为1∶750），NF-κB p65（比例为1∶7 500），孵育Ⅰ抗过夜，孵育Ⅱ抗1 h，显影并计算灰度值。

4 统计学处理

利用SPSS 26.0 软件进行统计分析。正态性分布数据用均值±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 TA对CIRI大鼠一般情况的影响

术后大鼠左侧眼睑呈半张开状态，眼睑瘀血结痂，严重者左眼不睁，并伴有不同程度的肢体运动障碍，活动量减少，部分大鼠尾尖出现瘀血青紫甚至枯萎。

2 TA对CIRI大鼠神经功能评分影响

CIRI 术后1 d、3 d、 7 d 及14 d 的大鼠神经功能评分均较sham 组升高（P＜0.01）；与model组相比，给药后3 d、7 d、14 d TA 组及DON 组评分显著降低（P＜0.01），见图1。

Figure 1. Comparison of neurological function scores of the rats in each group. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs sham group； ##P＜0.01 vs model group.图1 各组大鼠神经功能评分

3 TA对CIRI大鼠形态学影响

分别给药7、14 d，与sham 组大鼠相比，model 组海马CA1 区和皮质区神经元数量显著减少，神经元和尼氏小体排列较松散紊乱，尼氏小体减少甚至溶解，细胞出现严重的核固缩、空泡化现象；与model组相比，TA 组及DON 组大鼠神经元增多，细胞排列的相对整齐紧密，空泡化及核固缩现象减轻，尼氏小体较多，见图2、3。

Figure 2. Pathological changes of the brain tissue of rats in each group at 7 d after CIRI （HE and Nissl staining，scale bar=100 μm）.CA1： hippocampal CA1 region； CTX： cortex.图2 各组大鼠术后7 d脑组织病理变化

Figure 3. Pathological changes of the brain tissue of rats in each group at 14 d after CIRI （HE and Nissl staining，scale bar=100 μm）. CA1： hippocampal CA1 region； CTX： cortex.图3 各组大鼠术后14 d脑组织病理变化

4 TA对CIRI大鼠神经元凋亡的影响

给药14 d，与sham 组大鼠相比，model 组的神经元凋亡增多（P＜0.01）；与model 组相比，TA 组及DON组大鼠神经元凋亡降低（P＜0.05），见图4。

Figure 4. Neuronal apoptosis in rats of each group （TUNEL staining，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.图4 各组大鼠神经元凋亡情况

5 TA 对CIRI大鼠Iba1、Arg1和TLR4阳性表达的影响

5.1 TA 对M1 型小胶质细胞标志物Iba1 和M2 型小胶质细胞标志物Arg1 的影响 给药7、14 d，与sham组相比，model组大鼠Iba1阳性细胞在皮质区表达较为显著，胞体明显增大，突起回缩，呈现出阿米巴样；Arg1 阳性表达细胞数量增加。与model 组相比，TA组及DON 组大鼠Iba1 表达减少，胞体较小，突起较长；Arg1阳性细胞表达有所增加，见图5、6。

Figure 5. Localization and expression of Iba1 protein in the brain tissue of rats at 7 and 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CA3： hippocampal CA3 region； CTX： cortex.图5 各组大鼠7、14 d脑组织Iba1蛋白定位表达

Figure 6. Localization and expression of Arg1 protein in the brain tissue of rats at 7 and 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CTX： cortex.图6 各组大鼠脑组织Arg1蛋白定位表达

5.2 TA 对TLR4/MyD88/NF-κB 通路中TLR4 的阳性表达的影响 给药14 d，与sham 组相比，model 组大鼠TLR4 阳性细胞表达增加；与model 组相比，TA 组及DON组大鼠TLR4表达有所降低，见图7。

Figure 7. Localization and expression of TLR4 protein in the brain tissue of rats at 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CTX： cortex.图7 各组大鼠14 d脑组织TLR4蛋白定位表达

6 Western blot法测定结果

6.1 TA 对CIRI 大鼠Iba1、Arg1、IL-6、IL-4 和IL-10蛋白表达的影响 与sham 组相比，model 组大鼠海马Iba1、IL-6 和Arg1 表达量升高（P＜0.01），IL-4 和IL-10 表达量降低（P＜0.05）；与model 组相比，TA 组和DON 组Iba1 和IL-6 表达显著降低（P＜0.01），Arg1、IL-4和IL-10蛋白表达升高（P＜0.05），见图8。

Figure 8. Protein expression in hippocampal tissue of rats in each group. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.图8 各组大鼠海马组织相关蛋白的表达

6.2 TA 对CIRI 大鼠TLR4/MyD88/NF-κB 通路相关蛋白表达的影响 与sham 组相比，model 组大鼠海马的TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65和p-IκB表达量增多（P＜0.05）；与model 组相比，TA 组和DON组各指标表达量降低（P＜0.05），见图9。

Figure 9. The levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathway-related proteins in the hippocampal tissue of rats in each group. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.图9 各组大鼠海马组织TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达

讨 论

小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫细胞，通常处于静态。小胶质细胞具有三个基本功能，参与并不断监测内环境变化，促进神经元的修复，以及必要的防御功能，从而为神经提供保护作用［9］。当有神经元损伤或其他损伤时，小胶质细胞将被激活，激活的小胶质细胞会成为一把双刃剑，具有鲜明表型变化的神经损害型M1 和神经保护型M2。M1 型将损害周围的健康神经组织，并且通过死亡或正在死亡的神经元反过来加剧M1型小胶质细胞的活化，引起神经元的渐进性丧失［10-11］。而M2型可以减少局部组织的损伤，并促进损伤区域的修复和再生。因此，促进M1型小胶质细胞到M2型的极化形式，已然成为一种新的治疗策略。研究表明调控小胶质细胞极化对于减轻脑缺血后神经元凋亡，促进神经发育和功能恢复至关重要［12］。本研究中CIRI大鼠细胞凋亡数量增多，神经功能评分降低，病理损伤严重，TA可有效缓解这一状态，说明TA 有明确的保护脑神经功能作用，具有抗凋亡功能。

为明确TA 对M1/M2型小胶质细胞极化的影响，我们进行了相关指标的检测。机体损伤后，M1 型小胶质细胞被激活，胞体变大，出现不规则突起，呈阿米巴状，并且释放TNF-α、IL-6等促炎细胞因子，参与神经炎症的发生发展，导致病情加重。Iba1 作为小胶质细胞的特异性标志物，可判断小胶质细胞的激活情况［13-15］。小胶质细胞的另一种状态M2 型，以Arg1 为标志物，产生IL-4 和IL-10 等抑炎因子，可促进组织的修复及再生，具有神经保护作用［16-17］。本研究中，CIRI 大鼠M1 型小胶质细胞被激活，炎症因子IL-6 表达升高，抑炎因子IL-4 和IL-10 表达降低；TA降低了炎症因子分泌，促进了抑炎因子释放，同时，抑制了M1型小胶质细胞，激活了M2型小胶质细胞。这提示TA对CIRI炎症损伤具有一定的治疗作用，可能是通过抑制促炎M1型，促进抗炎M2型极化，从而发挥抗炎作用。

在中枢神经系统中，Toll样受体是一类模式识别受体的重要成员，小胶质细胞是中枢神经系统中Toll样受体表达最丰富的细胞类型，其中TLR4具有特异性识别病原体分子的作用。TLR4 的激活可以通过MyD88 依赖和非依赖途径，磷酸化并降解IκB 蛋白，继而激活NF-κB 通路，增加炎症因子的表达，引起炎症反应，导致细胞凋亡［15，18-19］。有研究表明，降低小胶质细胞中TLR4 和MyD88 的表达可以有效抑制NF-κB 的激活，减轻炎症反应，并减少神经功能损伤［18］。本研究指标中，CIRI 大鼠TLR4、MyD88、NFκB p65、p-NF-κB p65 等蛋白含量显著升高，TA 显著降低了各项指标的表达。这提示TA 可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路发挥抗炎作用。

综上所述，TA 对脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用，减少神经元的凋亡，降低炎症因子IL-6 的分泌，增强抑炎因子IL-4、IL-10 释放，其机制可能与调控M1/M2 型小胶质细胞、抑制TLR4/MyD88/NF-κB介导的炎性通路有关。