低氧在Erastin 诱导的胰腺导管腺癌细胞铁死亡中的作用及其机制

高钦玥 宋 廉 吴琪炜 魏士杰 刘 赛 龚爱华 朱海涛 王冬青

1.江苏大学附属医院影像科，江苏镇江 212000；2.江苏大学医学院，江苏镇江 212000

铁死亡，2012 年新定义的一种细胞程序性死亡[1]，由铁依赖性的磷脂过氧化物堆积引起[2-3]。正常生理条件下，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）以还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）为底物将细胞毒性的过氧化脂质转化为无毒的脂醇[4]，当小分子化合物Erastin 作用谷氨酸/胱氨酸转运体（XC-系统）时[5-6]，抑制胱氨酸转入导致还原型GSH 合成降低并引起GPX4 活性下降[7-8]，最终胞内脂质过氧化物不能被及时清除发生铁死亡[9]。胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adeno carcinoma，PDAC）已被证实依赖半胱氨酸代谢预防活性氧（reactive oxygen species，ROS）过多诱发的铁死亡，抑制XC-系统药物可能成为临床PDAC 治疗的重要手段[10-11]。但低氧是PDAC 药物治疗抵抗原因之一[12-13]，低氧是否引起PDAC 中的Erastin 的耐药及其具体机制仍需验证。本研究将Erastin 用于低氧培养的PDAC 细胞中检测铁死亡指标变化，并探讨低氧通过调控去乙酰酶Sirtuin3（SIRT3）影响铁死亡的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

人PDAC 细胞株PANC1，鼠PDAC 细胞panc02（中国科学院上海细胞研究所）；DMEM 高糖培养基（SH30243.01），PBS（SH30256.01）购于美国Hyclone 公司；澳洲胎牛血清（10099141）购于美国Gibco 公司；铁死亡挽救剂Ferrostatin-1（HY-100579），坏死挽救剂Necrostatin-1（HY-15760），凋亡挽救剂Z-VAD-FMK（HY-16658B），SIRT3 抑制剂3-TYP（HY-108331），Erastin（HY-15763）购于美国Med Chem Express 公司；引物合成于上海生工公司；6 孔细胞培养板（3516）、96 孔细胞培养板（3599）购于美国Corning 公司；CCK-8试剂盒（CK04）购于日本同仁化学；BCA 蛋白检测试剂盒（23227）购于Thermo Fisher Scientific 公司。多功能酶标仪800 TS 购于美国Bio Tek 公司；倒置荧光显微镜Axio Observer A1 购于蔡司公司；RT-qPCR 仪CFX96 购于美国Bio-Rad 公司；台式离心机购于Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 PANC1、panc02 用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养，常规传代，置于37℃、5%CO2细胞培养箱。低氧培养：细胞置于低氧培养盒，充入低氧混合气（1%O2，5%CO2，94%N2，南大恒通气体厂），充气10 min 放入37℃培养箱，隔天换气1 次。

1.2.2 细胞活性检测 取对数生长期PANC1，panc02细胞接种于96 孔板，每组设3 个复孔，每孔2000 个细胞；次日细胞贴壁后，经DMSO 或Erastin（5.0 μmol/L）处理，分别置于常氧和低氧培养条件；72 h 后，吸净上清，将100 μL 培养基添加10 μL 细胞计数试剂-8（cell counting kit-8，CCK8）的混合溶液加入每孔，常氧或低氧孵育1～2 h，酶标仪测定450 nm 处各组的OD 值。其他药物处理浓度分别为Ferrostatin-1（1 μmol/L），Necrostatin-1（1 μmol/L），Z-VAD-FMK（1 μmol/L），SIRT3 抑制剂3-TYP（20.0 nmol/L）。

1.2.3 RT-qPCR 检测SIRT3 mRNA 的表达水平 取对数生长期的PANC1 细胞种于六孔板中，经DMSO 和Erastin（5.0 μmol/L）分别处理后放入常氧和缺氧培养条件，孵育72 h 用TRIzol 试剂提取总RNA，按照试剂盒说明书得到cDNA（K1691，Thermo ScientificTM）。反应条件：95℃5 s，61.7℃30 s，72℃30 s，共40 个循环。SIRT3 引物序列为5’-GCATTCCAGACTTCAGATCGC-3’，5’-GTGGCAGAGGCAAAGGTTCC-3’，以ACTB 基因为内参照（5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’），每个基因设3 个复孔，使用2-ΔΔCt值计算目的基因的相对表达量。

1.2.4 MDA 和还原性GSH 测定 细胞培养方式和处理时间同“1.2.3”，根据产品说明书使用丙二醛（MDA）检测试剂盒（A003-1，南京建成）和微量还原型GSH（A006-2，南京建成）测定MDA 和还原型GSH 的相对浓度，BCA法测定样品的蛋白浓度。

1.2.5 小鼠模型 C57 老鼠购于江苏大学动物中心，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0010，合格证编号：202010408。饲养条件：相对湿度40%，温度26℃，适应性饲养1 周。低氧或常氧预培养72 h 的panc02 细胞（每只5×105细胞）皮下注射到雌性C57 左后侧造模。采用随机数字表法分组（共20 只，每组5 只）：①常氧DMSO 组：注射等体积DMSO；②常氧Erastin组：注射15 mg/kg Erastin 溶液；③低氧DMSO 组：注射等体积DMSO；④低氧Erastin 组：注射15 mg/kg Erastin 溶液。当肿瘤体积达到约80 mm3时，治疗14 d，隔2 d 注射1 次。通过测量肿瘤重量、长度（L）和宽度（W）监测小鼠肿瘤的生长；基于卡钳测量的肿瘤体积采用修正椭球公式计算[肿瘤体积=1/2（LW2）]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧抑制Erastin 诱导PANC1 细胞铁死亡的效果

常氧Erastin 组加入Ferrostatin-1 的细胞活性高于常氧Erastin 组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。加入Z-VAD-FMK 和Necrostatin-1 的细胞活性与常氧Erastin 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），见图1A。低氧Erastin 组的细胞活性及还原型GSH 相对含量高于常氧Erastin 组，MDA 相对含量低于常氧Erastin 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图1B～D。

图1 低氧抑制Erastin 诱导PDAC 细胞铁死亡的效果

2.2 低氧上调SIRT3 抑制Erastin 诱导PDAC 细胞铁死亡的效果

低氧Erastin 组的SIRT3 mRNA 相对表达量高于常氧Erastin 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图2A。低氧Erastin 组SIRT3 表达被抑制后的细胞活性低于低氧Erastin 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），常氧Erastin 组加或不加3-TYP 的细胞活性未见变化，差异无统计学意义（P ＞0.05），见图2B。

图2 低氧上调SIRT3 抑制Erastin 诱导PDAC 细胞铁死亡的效果

2.3 低氧抑制Erastin 体内治疗效果

panc02 的低氧Erastin 组细胞活性高于常氧Erastin 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图3A。常氧Erastin 组的肿瘤体积小于常氧DMSO 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。低氧Erastin 组的肿瘤大小与低氧DMSO 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），见图3B。

图3 低氧抑制Erastin 体内治疗的效果

3 讨论

本研究中Erastin 引起的细胞死亡仅可被铁死亡挽救剂抑制，凋亡和坏死抑制剂不能挽救，且常氧Erastin 组的还原型GSH 相对水平减少，脂质过氧化物MDA 增高，符合Erastin 诱导铁死亡的特征[14-16]。低氧Erastin 组的细胞活性水平明显高于常氧Erastin组。并且低氧Erastin 组内抗氧化物还原型GSH 升高，MDA 水平减少，提示低氧Erastin 组的抗氧化水平升高。以上显示，低氧抑制Erastin 诱导的PDAC 细胞铁死亡。

Erastin 引起的半胱氨酸缺乏[17]促进谷氨酰胺分解引起线粒体膜电位超极化和ROS 增加[18-19]。SIRT3作为重要的线粒体蛋白脱乙酰酶，调控细胞内ROS水平和维持线粒体正常功能[20-21]。SIRT3 mRNA 相对水平在低氧Erastin 组中高于常氧Erastin 组的相对表达量，且抑制SIRT3 的表达后，低氧Erastin 组的细胞活性下降，提示SIRT3 在低氧抑制Erastin 诱导PDAC铁死亡中发挥作用。鉴于低氧诱导因子-1α 过表达细胞株和化学性低氧微环境[22]并没有真正的氧气剥夺，本研究根据文献提前72 h 低氧预培养panc02 使细胞处于慢性低氧状态[23-25]。研究结果显示，治疗第2 周，常氧Erastin 组开始有肿瘤抑制效果，低氧Erastin 组肿瘤体积与低氧DMSO 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），证实体内低氧抑制Erastin 诱导的胰腺导管腺瘤铁死亡。

综上所述，本研究首次阐明低氧通过SIRT3 抑制Erastin 诱导的PDAC 铁死亡，为胰腺癌的临床治疗提供了新思路，但仍有不足之处，未进行SIRT3 基因质粒干扰验证以及体内低氧模型可进一步优化。