采摘时间与干燥方式对藏产红花药材质量的影响

梁从莲,韩文悦,王智超,刘红燕,张永清*

(1.山东中医药大学药学院,山东 济南 250355;2.山东中医药大学实验中心,山东 济南 250355)

药材红花为菊科植物红花(CarthamustinctoriusL.)的干燥管状花,药用历史悠久,其性温、味辛,归心、肝经,具有活血通经、散瘀止痛等功效,用于治疗经闭、痛经、恶露不行、癥瘕痞块、胸痹心痛、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌扑损伤、疮疡肿痛等[1-2]。红花也是重要的藏药之一,藏语名“Ku-gong”,藏医临床多用于治疗痛经、难产、外伤、血瘀、肝炎、肝热,被誉为“保肝圣药”[3-4]。含有红花的藏药成方较多,如“十四味羚羊角丸”“石榴日轮丸”“二十五味松石丸”“七味铁屑丸”等[5]。现代研究显示,红花含有黄酮类、生物碱类、倍半萜类、有机酸类等成分,其中黄酮类是红花的主要活性成分,也是活血化瘀的药效物质[6-7]。我国红花栽培历史悠久,早在汉代就有关于红花栽培和药用的记载,目前红花主产于新疆、四川、云南、河南等地,西藏部分地区也有栽培。有关红花种质资源、栽培技术、化学成分、药理活性等的研究文献众多,但鲜见藏产红花质量方面的研究。本文探讨了采收时间及干燥方式对藏产红花黄酮类、酚酸类成分含量及其提取液抗氧化活性的影响,旨在为提高和稳定藏产红花药材质量提供参考,助力藏药产业发展。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料红花样品采自西藏自治区山南市,原植物经山东中医药大学张永清教授鉴定,确认为菊科植物红花(C.tinctoriusL.)。分别在初花期(初开放为黄色时)、中花期(渐变为黄红色时)、盛花期(成熟为红色时)、败花期(在植株上枯败为土红色时)采摘开放的管状花,置于50 ℃烘箱热风烘干;将在盛花期采摘的鲜花,分别50 ℃烘干、阴干和晒干。以上样品充分干燥后,粉碎,过三号筛,避光密封保存备用。

1.2 仪器Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色谱分析仪(美国安捷伦科技有限公司);GFL-230型烘箱(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司);LG-01粉碎机(瑞安市百信制药机械有限公司);MSA6.6S-0CE电子天平[赛多利斯(上海)贸易有限公司];PL203型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);HH-S6数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司);SpectraMax M5酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司]。

1.3 试剂羟基红花黄色素A(纯度≥98%,批号：606H021)、山柰酚(纯度≥98%,批号：1208J022)、槲皮素(纯度≥99.85%,批号：MUST-22042012)、芦丁(纯度≥98%,批号：SR8250)、原儿茶酸(纯度≥98%,批号：310E023)、没食子酸(纯度≥98%,批号：1008U021)、1,1-二苯基-苦基肼(DPPH,纯度≥98%,批号：914S021)、2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS,纯度≥98%,批号：1031F022)均购自北京索莱宝科技有限公司。

流动相用甲醇、磷酸为色谱纯,水为纯净水,其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备羟基红花黄色素A、槲皮素、芦丁、原儿茶酸及没食子酸的方法依照文献[8]并稍做改进。取红花样品粉末约0.20 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,称定重量,超声处理(功率300 W,频率50 kHz,50 ℃)40 min,放冷,用50%甲醇补足减失的重量,2 000 r·min-1离心2 min,取上清液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。依照《中国药典》2020年版(以下简称药典)红花[1]中山柰酚制备方法制备山柰酚供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备精密称定羟基红花黄色素A、山柰酚、槲皮素、芦丁、原儿茶酸及没食子酸对照品各12.065、13.121、17.976、9.023、6.911、5.424 mg,加25%甲醇10 mL,制成混合标准品储备溶液,精密量取1 mL用25%甲醇稀释至10 mL,混匀。

2.1.3 色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相：选用0.7%的磷酸-水溶液(A)和甲醇(B)进行梯度洗脱;梯度条件：0～15 min,2% B→20% B;15～30 min,20% B→30% B;30～35 min,30% B;35～70 min,30% B→80% B;检测波长：254 nm;流速：1.0 mL·min-1;柱温：(30±0.8)℃;样品室温度10 ℃,进样量：10 μL。色谱图见图1。

1.没食子酸;2.原儿茶酸;3.羟基红花黄色素A;4.芦丁;5.槲皮素;6.山柰酚图1 混合对照品(A)、供试品(B、C)在254 nm下HPLC图

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验取“2.1.2”项下混合对照品溶液,连续进样6次,记录羟基红花黄色素A、山柰酚、芦丁、槲皮素、没食子酸、原儿茶酸峰面积,计算各成分峰面积的RSD值,结果显示的RSD值分别为0.9%、1.1%、1.2%、0.9%、1.3%、1.1%,证明仪器的精密度良好。

2.2.2 线性关系考察取混合标准品储备溶液1 mL,用25%甲醇分别定容于5、25、50、100、200 mL容量瓶中,配置成一系列浓度梯度的混合对照品线性溶液,按“2.1.3”项下色谱条件进行梯度洗脱,以样品浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,进行线性回归分析,并计算相关系数。结果如表1所示,由表1可知,6种成分在相应浓度范围内线性关系良好。

表1 各成分的回归方程、相关系数、线性范围

2.2.3 重复性试验取烘干处理的中花期红花粉末样品0.2 g,精密称定,平行6组,按“2.1.1”项分别制成两种供试品溶液,在“2.1.3”项下的色谱条件分别进样,计算羟基红花黄色素A、山柰酚、芦丁、槲皮素、没食子酸、原儿茶酸含量的RSD,结果显示6种成分含量的RSD值分别为1.4%、1.6%、0.9%、1.3%、0.9%、1.3%,表明该方法测定6种化学成分的重复性良好。

2.2.4 加样回收试验取已知含量的烘干处理的中花期红花粉末样品0.2 g,精密称量,按“2.1.1”项下分别制备成两种供试品溶液,平行9组,按1.5∶1、1∶1、1∶0.5分为高、中、低各3组,分别加入相应对照品,按“2.1.3”项中的色谱条件进行检测,计算羟基红花黄色素A、山柰酚、芦丁、槲皮素、没食子酸、原儿茶酸6种成分加样回收率,回收率范围分别为97.5%～101.8%、97.9%～101.2%、98.3%～100.9%、98.5%～101.5%、98.1%～102.3%、98.5%～102.7%,RSD值分别为1.8%、1.5%、0.9%、1.3%、1.7%、1.3%。

2.2.5 稳定性试验分别取“重复性”项下的两种供试品溶液的第一份,在“2.1.3”项下的色谱条件分别在0、2、4、6、10、16、24 h连续进样,记录羟基红花黄色素A、山柰酚、芦丁、槲皮素、没食子酸、原儿茶酸的峰面积,计算峰面积的RSD,分别为0.9%、0.7%、1.1%、0.9%、1.7%、1.9%,表明供试品溶液在10 ℃条件下,24 h内稳定性良好。

2.3 抗氧化活性分析样品提取：红花醇提取物制备参照文献[9]并稍做改进。精密称取红花样品0.2 g,加入50%甲醇25 mL,超声处理(功率300 W,频率50 kHz,50 ℃)30 min,2 000 r·min-1离心2 min,取上清液备用。

DPPH清除能力测定：参照文献[10]并稍做改进。移取上述红花样品提取液,用50%甲醇稀释适当倍数,向100 μL样品溶液中加入0.015 mg·mL-1DPPH溶液100 μL,混合均匀,室温避光放置30 min。在517 nm波长下测定反应溶液的吸光度。以50%甲醇作为空白对照。重复3次。根据以下公式计算 DPPH 自由基清除率：

DPPH自由基清除率(%)=1-(Ai-Aj)/Ao×100

其中,Ai为DPPH溶液+样品溶液的吸光度;Aj为样品溶液+50%甲醇溶液的吸光度;Ao为DPPH溶液+50%甲醇溶液的吸光度。

ABTS清除能力的测定：参照文献[11]并稍做改进。取7.4 mmol·L-1ABTS 储备液和2.6 mmol·L-1过硫酸钾溶液以1∶1(V/V)混匀,室温避光静置12 h后,作为ABTS工作液。移取上述红花提取液,用50%甲醇稀释适当倍数,向100 μL样品溶液中加入上述配制的ABTS工作液100 μL,混合均匀,室温避光下静置30 min,在734 nm波长下测定反应溶液的吸光度。以50%甲醇作为空白对照。重复3次。ABTS自由基清除率计算公式同DPPH。

3 结果与分析

3.1 采摘时间对藏产红花化学成分含量及抗氧化活性的影响

3.1.1 对化学成分含量的影响经测定,采摘时间对藏产红花化学成分含量的影响参见图2,藏产红花中羟基红花黄色素A、山柰酚含量在4个不同时期采摘均符合药典标准。羟基红花黄色素A、芦丁含量显示中花期>盛花期>初花期>败花期,山柰酚、原儿茶酸含量显示中花期>盛花期>败花期>初花期,槲皮素含量显示败花期>盛花期>中花期>初花期,没食子酸含量显示中花期>初花期>盛花期>败花期。4个花期之间的没食子酸含量均有显著性差异(P<0.05),中花期和盛花期的羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素和山柰酚含量无显著性差异,盛花期和败花期的原儿茶酸含量无显著性差异。

图2 采摘时间对藏产红花6种化学成分含量的影响

3.1.2 对抗氧化活性的影响经测定,不同花期红花甲醇提取液对DPPH和ABTS自由基的清除能力如图3所示,采摘时间对藏产红花抗氧化活性的影响较大。中花期、盛花期采摘的红花对两种自由基的清除率均较高,说明这两个时期的红花抗氧化活性较强。拟合各采摘时间抗氧化活性曲线,得出红花DPPH自由基清除率的IC50值在初花期、中花期、盛花期和败花期分别为3.232、2.422、2.625、5.257;ABTS自由基清除率的IC50值在初花期、中花期、盛花期和败花期分别为0.416、0.306、0.340、0.578。

图3 采摘时间对藏产红花DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除率的影响

3.2 干燥方法对藏产红花化学成分含量及抗氧化活性的影响

3.2.1 对化学成分含量的影响干燥方式对藏产红花化学成分含量的影响如图4所示,阴干、晒干与烘干藏产红花的羟基红花黄色素A和山柰酚含量均符合国家药典标准,且羟基红花黄色素A含量均是药典规定标准的2倍以上。烘干红花的羟基红花黄色素A、芦丁和没食子酸3种成分含量均最高,分别是阴干和晒干的1.024、1.243,1.149、1.182,1.239、1.257倍。阴干红花的山柰酚和槲皮素含量最高,分别是烘干和晒干的1.061、1.273倍及1.208、1.203倍。晒干红花的原儿茶酸含量最高,分别是阴干和烘干的1.226、1.314倍。差异性分析结果显示,阴干、晒干及烘干红花的羟基红花黄色素A和没食子酸含量均有显著性差异(P<0.05),而阴干与烘干红花的山柰酚、原儿茶酸含量,烘干与晒干红花的槲皮素含量,阴干和晒干红花的芦丁含量,均无显著性差异。

图4 干燥方式对藏产红花6种化学成分含量的影响

3.2.2 对抗氧化活性的影响干燥方式对藏产红花抗氧化活性的影响,如图5所示。图5结果显示,干燥方式对藏产红花抗氧化活性影响较大。烘干红花对两种自由基的清除率均高于其他2种干燥方式,其次是阴干和晒干。拟合各干燥方式抗氧化活性曲线,得出红花DPPH自由基清除率的IC50值在烘干、阴干和晒干的处理下分别为2.670、3.185、5.656;ABTS自由基清除率的IC50值在烘干、阴干和晒干的处理下分别为0.339、0.416、0.757。

图5 干燥方式对藏产红花DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除率的影响

3.3 统计分析

3.3.1 化学成分与抗氧化活性间的相关性分析采用Excel软件,将不同时间采摘、不同方式干燥藏产红花DPPH、ABTS的IC50值,分别与6种化学成分含量进行灰色关联度分析,结果如表2所示,藏产红花6种化学成分含量与DPPH、ABTS IC50值的关联系数均大于0.6,表明关联度较高。

表2 藏产红花化学成分含量与抗氧化活性间的灰色关联系数

采用SPSS软件中的斯皮尔曼法进行双变量相关性分析,结果如表3所示,藏产红花DPPH IC50值与羟基红花黄色素A、芦丁含量,ABTS IC50值与羟基红花黄色素A、芦丁、没食子酸含量,存在显著负相关(P<0.05);而没食子酸和山柰酚的含量与DPPH的IC50值中度相关,山柰酚、槲皮素和原儿茶酸的含量与ABTS的IC50值中度相关。

表3 藏产红花6种化学成分和抗氧化活性的双变量相关性分析

3.3.2 回归分析采用SPSS软件中的偏最小二乘法分别对两种抗氧化活性的IC50值和显著相关成分之间建立多元回归方程,其中以IC50值为因变量,相关成分为自变量,DPPH的多元回归方程为Y=10.240-2.374X1-11.559X2,X1为羟基红花黄色素A,X2为芦丁;ABTS的多元回归方程为Y=1.420-0.320X1-0.320X2-9.366X3;X1为羟基红花黄色素A,X2为芦丁,X3为原儿茶酸。在DPPH的多元回归方程中,芦丁系数为-11.559,在回归方程里负向贡献最大,且在相关性分析中,芦丁含量与抗氧化活性的相关系数为-0.893,也是具有极显著(P<0.01)负相关的成分。在ABTS的多元回归方程中,没食子酸的系数为-9.366,在回归方程里负向贡献最大,羟基红花黄色素A、芦丁的系数均为-0.320,贡献较小。综上,在清除DPPH自由基的过程中,6种成分起主要作用的是芦丁,而在清除ABTS自由基的过程中,没食子酸为发挥主要作用的成分。

4 讨论与结论

红花在开花过程中会经历因化学成分变化导致的花色变化,因此,为了获得花色好、有效成分含量高的红花药材,适宜的采摘时间非常重要。丁丽丽等[12]研究表明红花羟基红花黄色素A的含量变化为盛花期>始初期>花蕾期>衰落期;山柰酚的含量变化为衰落期>盛花期>始初期>花蕾期。胡喜巧等[13]对始花期、盛花期和衰落期的新乡红花进行黄酮、羟基红花黄色素A、多糖含量的测定,结果以上成分在红花盛开后3～4 d左右的盛花期含量最高。干燥是中药材加工必不可少的环节,干燥能降低药材的含水量,便于贮藏运输。中药材的干燥方法较多,较常用的有晒干、阴干、烘干、红外干燥等。不同干燥方法由于干燥时间、温度控制等不同,形成的药材在性状、成分含量上存在差异。如张彦等[14]分别测定了阴干、晒干、45 ℃烘干和60 ℃烘干处理下新疆产红花羟基红花黄色素A和山柰酚的含量,结果发现45 ℃烘干条件下两种成分保留的更多。许兰杰等[15]研究发现红花中的羟基红花黄色素A随着温度50～100 ℃范围内升高呈直线下降趋势,说明采用50 ℃以下的烘干温度能使羟基红花黄色素A得到更多的保留。

药典规定红花药材的采收加工为夏季花由黄变红时釆摘,阴干或晒干。据实地观察,藏产红花花色会经历黄色、橙色、红色至土红色的变化;红花药材在当地加工时,常采用晒干、阴干和低温烘干。为此本研究收集了黄色初花、橙色中花、红花盛花和土红色败花几种花期的红花,选择产地常用3种干燥方式,考察其中4种黄酮类成分和2种酚酸类成分的含量及其提取液抗氧化性的影响。结果表明,中花期红花羟基红花黄色素A、芦丁、山柰酚、原儿茶酸和没食子酸的含量均是最高的,且中花期和盛花期的羟基红花黄色素A、芦丁、山柰酚和槲皮素含量无显著性差异;抗氧化活性测定结果也表明,中花期和盛花期采摘的红花对两种自由基清除率较高;因此在藏产红花的实际生产中,应该尽量于花冠发育至黄红色到红色期间进行采摘。采摘过早,不仅药效成分含量少、抗氧化活性较弱,产量也较低;采摘过晚,红花干枯,药材色泽变差,药效成分含量也较低。烘干红花羟基红花黄色素A、芦丁和没食子酸的含量最高,阴干红花山柰酚和槲皮素的含量最高,但阴干和烘干红花的山柰酚含量无显著性差异;且烘干红花两种自由基清除率均是最高的,其次为阴干和晒干;因此在藏产红花的产地加工过程中,应该尽量选择低温烘干的方式,没有烘干设备的条件下尽量选择通风处阴干,并注意时时翻动。