泽泻汤对高脂血症模型小鼠CYP450酶亚型的影响

鞠爱霞,周育生,单万亭,刘莉,李秋红

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学药学院,黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江省药品检验研究院,黑龙江 哈尔滨 150088)

高脂血症是诱发冠心病、心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病的主要危险因素之一,有效防治高脂血症是预防心脑血管疾病发生的重要途径。泽泻汤出自《金匮要略》,由泽泻、白术两味中药配伍而成,具有降血脂、抗高血压、抗炎等作用[1]。《金匮要略》原文记载：“心下有支饮,其人苦冒眩,泽泻汤主之”。该方成分复杂、作用靶点多,在体内可能会影响细胞色素P450(CYP450)酶的活性或表达,进而对其他联合应用药物的代谢产生影响[2-3]。CYP450酶是非常重要的Ⅰ相代谢酶,可影响多种药物在体内的代谢,具有多种亚型,易受性别、年龄、药物、病理及生理状态等因素影响[4]。因此,明确CYP450酶与中药的相互作用关系对于合理配伍中药、提高中药疗效、减少药物的毒副作用至关重要。为探究泽泻汤配伍规律及配伍的合理性,明确泽泻汤及其拆方对高脂血症模型小鼠CYP450酶亚型的影响,本研究以高脂血症模型小鼠为基础,分别采用“Cocktail”探针药物法和qPCR技术,探究泽泻汤全方及拆方对高脂血症状态下小鼠CYP450亚酶活性及基因表达量的影响,为泽泻汤的合理应用及进一步开发提供数据支持。

1 材料

1.1 主要仪器LC-2010C型高效液相色谱仪(日本岛津公司);Synergy MX型酶标仪(美国Biotek公司);StepOnePlus型实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);SmartSpec Plus型核酸蛋白浓度分析仪(上海艾研生物科技有限公司);AR2140型电子分析天平;DELTA320型pH计(梅特勒-托利多仪器公司);DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);TGL16M型台式高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司);BioSpectrum AC Chemi HR 410型UVP凝胶成像系统(美国);DYY-11B型三恒电泳仪(北京六一生物科技有限公司);BDF-86V50型-80 ℃冰箱(济南卓隆生物科技有限公司)。

A.空白肝微粒体;B.空白肝微粒体+混合探针药物+内标;C.给药后肝微粒体+混合探针药物+内标 1.咖啡因;2.氯唑沙宗;3.甲苯磺丁脲;4.地西泮图1 混合探针药物肝微粒体样品色谱图

1.2 主要药品与试剂泽泻、白术两味中药饮片均购自北京同仁堂哈尔滨药店,经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定饮片符合《中国药典》2020年版(一部)标准;咖啡因对照品(批号：1108349)、甲苯磺丁脲对照品(批号：20110601)、氯唑沙宗对照品(批号：20110701)、睾酮对照品(批号：MB1636-S)均购自大连美仑生物技术有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：BL521A)购自北京兰杰柯科技有限公司;琼脂糖(批号：111860)购自北京维百奥生物科技有限公司;DEPC水(批号：20171204)、SuperRed/GelRed核酸染料(批号：21078812)、RNA上样缓冲液(批号：6909624)、DNA上样缓冲液(批号：70090500)、D2000 DNA Ladder(批号：21053625)、Taq plus Master Mix含染料(批号：70120054)、逆转录试剂盒(含DNase)(批号：21049684)均购自北京兰杰柯科技有限公司;WCGENE mRNA qPCR定量试剂盒(批号：WC-SJH0002)购自上海沃吉基因科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱级。

1.3 实验动物及饲养环境本研究所用动物为SPF级雄性KM小鼠,体质量为18～22 g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供,实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001,实验动物使用许可证号：SCXK(黑)2018-007。将小鼠饲养于温度(23±2) ℃、湿度45%～65%、12 h明暗交替的动物房中,饲养期间小鼠正常摄食和饮水。

2 方法

2.1 药物制备泽泻汤冻干粉：泽泻、白术两味中药以5∶2的比例,等比例扩大,加入8倍量蒸馏水,浸泡30 min后,冷凝回流煎煮1.5 h,获取药液,再煎煮1 h,再次获取药液,过滤后,合并两次滤液,浓缩。将浓缩后的水煎液倒入托盘,放入冷冻干燥机中,得到冻干粉,计算泽泻汤冻干粉浓度为4.4 g·g-1。

泽泻冻干粉：同泽泻汤冻干操作方法,得到泽泻冻干粉浓度为7.15 g·g-1。

白术冻干粉：同上述操作方法,得到白术冻干粉浓度为2.4 g·g-1。

2.2 分组、造模与给药50只KM小鼠随机分为空白组10只和高脂组40只,参考相关文献[5]的方法建立高脂血症模型,空白组饲喂基础饲料,其余4组小鼠饲喂高脂饲料(配方组成：维持饲料65%、猪油10%,糖15%、奶粉5%、蛋黄粉5%),自由进食、饮水,饲喂6周后,当小鼠血清中TC>2.4 mmol·L-1时表示高脂血症小鼠造模成功。造模结束后,泽泻汤组、泽泻组、白术组小鼠每天灌胃给药持续28 d,小鼠给药剂量根据泽泻汤的成人用药剂量采用体表面积表折算(泽泻汤组、泽泻组、白术组给药剂量分别为12.0、8.6、3.4 g·kg-1),空白组、模型组均给予同体积生理盐水。

2.3 取材末次给药24 h后将大鼠颈椎脱臼处死,解剖取出肝脏用预冷的0.9% NaCl溶液冲洗肝脏表面血渍,称量肝脏质量后,部分肝脏放入4%多聚甲醛中浸泡,剩余肝脏迅速置于液氮中固定,随后放入冰箱-80 ℃保存备用。

2.4 小鼠肝脏中CYP450酶亚型酶活性检测

2.4.1 肝微粒体混悬液的制备参考相关文献[6],采用氯化钙沉淀法在4 ℃环境中制备小鼠肝微粒体混悬液,防止肝药酶失活变性,采用BCA法测总蛋白含量。

2.4.2 肝微粒体体系孵育及加样流程肝微粒体体系(蛋白含量为0.4 mg·mL-1的小鼠肝微粒体,浓度为1 mmol·L-1NADPH,混合探针药物(咖啡因15 μmol·L-1、甲苯磺丁脲20 μmol·L-1、氯唑沙宗20 μmol·L-1)/单一探针药物(睾酮25 μmol·L-1及磷酸盐缓冲液的总体积为500 μL的体系)孵育30 min后,加入4 ℃预冷含有8 μg·mL-1地西泮的甲醇终止液500 μL,混匀后,12 000 r·min-1离心15 min,取上清20 μL进入HPLC分析。

2.4.3 色谱条件肝微粒体中CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶活性测定的色谱条件：采用Diamonsil C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以0.05 mmol·L-1pH为3.4的甲醇：磷酸氢二铵缓冲溶液=56∶44(V/V)为流动相进行等度洗脱;检测波长为230 nm;柱温为30 ℃;流速为0.8 mL·min-1。

肝微粒体中CYP3A4酶活性测定的色谱条件：采用Diamonsil C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈∶水=50∶50(V/V)为流动相进行等度洗脱;检测波长为245 nm;柱温为30 ℃;流速为1.0 mL·min-1。

建立了同时测定咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲3种探针药物以及单独测定睾酮的高效液相色谱法。

2.4.4 相对酶活性计算测定4种探针药物咖啡因、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮的峰面积,将其与内标地西泮峰面积的比值代入各探针底物的肝微粒体标准曲线中,计算出各探针药物在样品中的浓度。无活性组作为总底物浓度,其余各实验组为剩余底物浓度,根据下式计算：相对酶活性=(总底物浓度-剩余底物浓度)/总底物浓度×100%。

2.5 小鼠肝脏中CYP450酶亚型相关基因表达检测提取大鼠肝脏总RNA(参照动物总RNA快速抽提试剂盒说明书)进行质量检测,随后逆转录为cDNA。实时荧光定量PCR总反应体系为10 μL,包含上下引物各0.2 μL、5 μL SYBR Green、0.2 μL 50×ROX Reference Dye 2、2.4 μL 超纯水以及2 μL cDNA模板。反应条件：95 ℃预变性10 min;40次循环(95 ℃变性15 s;60 ℃退火/延伸30 s);65 ℃到95 ℃每升高0.5 ℃采集一次荧光信号。引物由上海生工生物工程有限公司提供(见表1)。

表1 引物序列

3 结果

3.1 方法学考察专属性考察结果表明,各色谱峰峰形尖锐,且分离度良好,各肝微粒体的内源性物质及内标地西泮在相应色谱条件下不干扰咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睾酮的测定,该方法专属性良好。该方法的灵敏度、准确度、精密度、稳定性均较高,满足生物样品的各项方法学考察要求。探针药物之间以及与内标地西泮不产生相互干扰,能够特异性检测出各CYP450酶亚型的活性。肝微粒体样品色谱图见图1～2。

3.2 泽泻汤及其拆方对CYP450酶亚型酶活性的影响如表2所示,与空白组相比,模型组CYP2E1、CYP3A4酶活性显著降低(P<0.01),CYP1A2、CYP2C9酶活性差异无统计学意义。与模型组相比,泽泻汤组、泽泻组、白术组均诱导了CYP3A4酶活性(P<0.01);泽泻汤组、泽泻组、白术组对CYP2E1酶活性有抑制作用(P<0.01或P<0.05);泽泻汤组对CYP1A2酶有抑制作用(P<0.05);泽泻汤组、泽泻组、白术组对CYP2C9酶活性有抑制作用,但差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 泽泻汤及其拆方对CYP450酶亚型酶活性的影响

3.3 泽泻汤及其拆方对CYP450酶亚型基因表达的影响与空白组比较,模型组小鼠肝脏中CYP1A2、CYP3A4 mRNA表达水平均降低(P<0.05),模型组小鼠肝脏中CYP2E1、CYP2C9 mRNA表达水平无影响。与模型组相比,泽泻汤组、泽泻组小鼠肝脏中CYP1A2 mRNA表达水平均升高(P<0.05),白术组小鼠肝脏中CYP1A2 mRNA表达水平升高,但差异无统计意义;泽泻汤组小鼠肝脏中CYP2E1 mRNA表达水平降低(P<0.05);泽泻汤组、泽泻组、白术组小鼠肝脏中CYP3A4 mRNA表达水平均升高(P<0.05);泽泻汤组、泽泻组、白术组小鼠肝脏中CYP2C9 mRNA表达水平无影响,结果见表3。

表3 泽泻汤及其拆方对CYP450酶亚型基因表达的影响

4 讨论

泽泻汤临床应用广泛,也经常加味配伍使用或与其他药物联合使用,并且泽泻汤成分复杂,与其他药物联合用药时可能会发生配伍变化[7-9]。CYP450酶及其亚型是药物在体内发生相互作用的关键因素,CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9是CYP450酶系的主要亚型,目前上市药品经CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶代谢的达70%,因此,本研究选择上述4个亚型进行研究。明确泽泻汤及其拆方在疾病状态下对CYP450酶亚型酶活性及基因表达量的影响,能够使泽泻汤在临床上更合理地配伍使用,也尽量减少因药物相互作用产生的不良反应。

根据文献[10]和本课题组前期研究基础选择公认的探针药物进行CYP450酶亚型酶活性测定,肝药酶CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP3A4的特异性探针底物分别为咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、睾酮。探针药物之间以及与内标地西泮不产生相互干扰,能够特异性检测出各CYP450酶亚型的活性。由于本次实验探究了泽泻汤对CYP450酶4个亚型的影响,设置单一阳性药物对照对多个酶活性的探究意义不明显,因此,本研究并未单设阳性药物组。

对酶活性实验结果分析发现,高脂血症在动物水平可以显著降低CYP2E1、CYP3A4酶活性,提示临床上高脂血症患者使用经上述两种酶代谢的药物时,应考虑给药剂量,以避免造成药物蓄积。他汀类药物是具有代表性的一线降脂药物,其经过CYP3A4酶代谢[11]。研究发现,阿托伐他汀治疗携带CYP3A4*18B基因的患者比未携带者血药浓度高,调脂疗效更显著[12]。因此,高脂血症患者在服用阿托伐他汀等他汀类药物降脂时,应进行治疗药物监测,防止产生药物蓄积,避免出现横纹肌溶解等严重不良反应[13-14]。本研究结果显示,泽泻汤全方及拆方逆转了高脂血症对CYP3A4酶活性的抑制作用。另有研究表明,CYP3A4酶与脂代谢相关[15],因此,泽泻汤在对代谢酶产生影响的同时间接发挥了降脂作用,这也可能是其治疗高脂血症的机制,有待于进一步研究。研究表明,硝苯地平、氨氯地平等降压药物经CYP3A4代谢[16],与泽泻汤合用时,由于泽泻汤诱导CYP3A4酶,会加快硝苯地平在体内的代谢降低血药浓度,进而影响药效。格列本脲是临床上常用的降糖药物,其为CYP2C9的底物,而泽泻汤抑制CYP2C9酶的活性,所以,当格列本脲与泽泻汤同时使用时,会减少格列本脲在体内的代谢,增加其血药浓度,提高药效的同时可能会增加不良反应发生的风险。这些经CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶代谢的药物与泽泻汤联合使用时,极易发生相互作用影响药效,甚至会产生毒性反应。因此,当泽泻汤与副作用或毒性较大的药物联合使用时,应进行血药浓度监测,及时调整给药剂量,避免发生不良反应。

本研究还采用实时荧光定量PCR检测泽泻汤及其拆方对CYP450酶亚型基因表达的影响。实验结果表明,泽泻汤全方及其拆方逆转了高脂血症对CYP3A4 mRNA表达水平的抑制作用,与其对酶活性的影响具有一致性,且单味泽泻组与全方具有一致性,优于白术组,充分体现了泽泻在泽泻汤中的主导地位。同时,泽泻汤和泽泻还逆转了高脂血症对CYP1A2 mRNA表达水平的抑制作用。泽泻汤抑制了高脂血症小鼠CYP2E1 mRNA表达水平,与其对酶活性的影响一致,然而,单味泽泻组和白术组虽抑制了CYP2E1 mRNA表达水平,却对酶活性无影响。泽泻汤全方及其拆方对CYP2E1酶活性和基因表达不一致,可能是由于基因转录和蛋白质翻译受转录和翻译后修饰的影响,多肽链合成很多但功能化不足导致酶活性与基因表达量不成正比。

本研究以CYP450酶为核心,探索了泽泻汤及其拆方对高脂血症模型小鼠CYP450酶亚型酶活性及基因表达量的影响,为泽泻汤的合理应用及泽泻和白术配伍研究提供了理论基础,也为泽泻汤的进一步研究提供新思路。