UPLC-MS/MS法测定磷酸西格列汀中基因毒性杂质NTTP

2024-01-11袁松李婕张娜张龙浩刘阳张庆生

药学研究 2023年12期

袁松,李婕,张娜,张龙浩,刘阳,张庆生

(中国食品药品检定研究院,国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室,北京 102629)

N-亚硝胺类化合物(N-nitrosamines,NAs)是一类结构通式为R1(R2)N-N=O的化合物,其中R1和R2为烷基或芳烃,国际癌症研究机构于1987年将NAs列入致癌物清单。2017年世界卫生组织发布的致癌清单中,有近16个短脂肪链的N-亚硝胺类化合物被列为2类致癌物质[1]。NAs常常存在于食品、饮用水、烟草、化妆品等物质中[2-5],人们长期接触含NAs的这些物质会产生潜在危害。自2018年欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)宣布在缬沙坦原料和制剂中检测出N-亚硝基二甲胺(NDMA)后,各国药品监管机构纷纷加强对药品中NAs的监测,并对多批含有NDMA或其他亚硝胺类杂质的沙坦类药物进行召回,并要求对产品中NAs存在进行风险评估及建立合适的控制策略[6-9]。

西格列汀(结构式见图1)是一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂,可以刺激胰高血糖素的释放并减少胰岛素的分泌,从而发挥降糖作用,是一种常见的降糖药,可与其他药联合用药来治疗包括超重肥胖、胰岛素治疗不佳、肥胖型 2 型糖尿病等疾病,治疗效果良好[10-12]。2022年报道表明西格列汀合成中间体三氟甲基-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并-[4,3-α]-吡嗪盐酸盐(TTP)[13]可能与亚硝酸盐反应生成Nitroso-STG-19(NTTP,见图1)。NTTP是新发现的一种存在于西格列汀中的基因毒性杂质,可能是以TTP为原料合成西格列汀时产生或是最终产品中残留的TTP与辅料中微量的亚硝酸盐反应生成NTTP。EMA和美国食品药品监督管理局(FDA)最初都将其最大摄入量设定为37 ng·d-1,但FDA为了避免西格列汀产品的短缺,将最大摄入量调整为246.7 ng·d-1,暂未召回该产品[14-15]。目前国内外尚无对西格列汀中的NTTP检测方法的报道,本文建立了一个超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测西格列汀中NTTP的方法,为西格列汀相关原料药与制剂的药品质量控制和监管提供参考。

图1 西格列汀、TTP和NTTP的结构式

1 材料

1.1 仪器高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(美国Waters公司),配备电喷雾离子源(ESI)和MassLynx V4.2数据处理系统;XP205DR型电子分析天平(瑞士Mettler公司);Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)。

1.2 药物与试剂乙腈、甲酸、甲酸铵(质谱级,美国Fisher Scientific),水为超纯水,对照品NTTP来自本实验室合成,采用高分辨质谱(见图2A)和核磁(见图2B、C)对其结构进行了确证。

图2 结构确证-高分辨质谱图(A,H-ESI+)、核磁共振氢谱图(B)和碳谱图(C)

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 标准曲线溶液的制备取NTTP对照品约10 mg,精密称定,置100 mL量瓶中,加水使溶解并稀释至刻度,作为对照品储备液;精密量取对照品储备液适量,以水为稀释剂逐级定量稀释制成每1 mL中含NTTP 0.54、1.08、4.31、10.79、26.97、53.93 ng的溶液,作为系列线性溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取磷酸西格列汀原料药约100 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,加水适量,超声使溶解,用水稀释至刻度,摇匀,作为原料药的供试品溶液。取磷酸西格列汀片10片,精密称定,研细,混匀,精密称取约相当于磷酸西格列汀100 mg的细粉,置15 mL离心管中,精密加入水10 mL,超声并振摇10 min,滤过,取续滤液作为片剂的供试品溶液。

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 色谱条件采用Agilent Eclipse Plus C18RRHD(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)色谱柱,以含0.1%甲酸的水溶液为流动相A,0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B,梯度洗脱：0～8.0 min, 40%B→100%B;8.0～8.1 min,100%B→40%B;8.1～12.0 min,40%B;流速为0.35 mL·min-1,柱温为30 ℃,进样器温度为10 ℃,进样体积为5 μL。

2.2.2 质谱条件采用电喷雾离子源(Electrospray Ionization Source,ESI),正离子检测模式,毛细管电压为4.0 kV,脱溶剂气温度为500 ℃,脱溶剂气流量为1 000 L·h-1,锥孔气流量为150 L·h-1,离子源温度为150 ℃。监测模式为多反应监测(Multiple reaction monitor,MRM),以m/z 221.83→191.95作为定量离子对,锥孔电压为10 V,碰撞能量为10 V,以离子对m/z 221.83→164.71作为定性离子对,锥孔电压为10 V,碰撞能量为20 V。采集时间为2.3～8.0 min。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验取水作为空白溶剂和“2.1.1”项下约4 ng·mL-1的对照品溶液分别进样,记录色谱图,在所建立的色谱和质谱条件下,NTTP的保留时间为2.62 min(见图3A),峰型良好,空白溶剂对检测无干扰。

A.空白溶剂;B.对照品溶液;C.片剂供试品溶液图3 空白溶剂、对照品溶液和片剂供试品溶液提取的离子流色谱图

2.3.2 系统精密度取“2.1.1”项下约4 ng·mL-1的线性溶液连续进样6次,得NTTP峰面积的RSD为1.13%,结果表明系统精密度良好。

2.3.3 重复性

2.3.3.1 原料药重复性取磷酸西格列汀原料药(批号：SGZ1040006),按“2.1.2”项下方法平行制备6份原料药供试品溶液,进样检测,按标准曲线法计算NTTP含量,计算得6份原料药供试品溶液中NTTP含量的RSD为7.2%。结果表明方法对原料药测定具有良好的重复性。

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2.3.3.2 片剂重复性取磷酸西格列汀片,按“2.1.2”项下方法平行制备6份片剂供试品溶液,进样检测,按标准曲线法计算NTTP含量,计算得6份片剂供试品溶液中NTTP含量的RSD为3.3%,结果表明方法对片剂测定具有良好的重复性。

2.3.4 线性分别取“2.1.1”项下系列线性溶液,进样检测,记录色谱图。以质量浓度为横坐标 (X),NTTP峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,在0.54～53.93 ng·mL-1浓度范围内线性结果为Y=5 100.84X+539.79(r=1.000 0)。结果显示NTTP在其线性范围内峰面积与进样浓度之间呈良好的线性关系。

2.3.5 回收率试验

2.3.5.1 原料药回收率试验取磷酸西格列汀原料药(批号：GZ1040006)约100 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,分别用“2.1.1”项下25 ng·mL-1(高浓度)、10 ng·mL-1(中浓度)、4 ng·mL-1(低浓度)的线性溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为原料药回收率溶液,每个浓度点平行制备3份,进样检测,结果见表1,低、中、高浓度点的回收率分别为107.21% (RSD2.9%,n=3)、105.95% (RSD2.5%,n=3)、105.43% (RSD3.2%,n=3),结果表明原料药回收率良好。

表1 原料药加样回收率结果

表2 片剂加样回收率结果

2.3.5.2 片剂回收率试验取磷酸西格列汀片(批号：200515JA),精密称定,研细,混匀,精密称取细粉适量(约相当于西格列汀100 mg),置10 mL量瓶中,分别用“2.1.1”项下25 ng·mL-1(高浓度)、10 ng·mL-1(中浓度)、4 ng·mL-1(低浓度)的线性溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为片剂回收率溶液,每个浓度点平行制备3份,进样检测,结果见表3,低、中、高浓度点的回收率分别为115.03% (RSD2.1%,n=3)、115.95% (RSD3.6%,n=3)、120.20% (RSD1.4%,n=3),结果表明片剂回收率在可接受范围内。

2.3.6 检测限与定量限取“2.1.1”项下约0.5 ng·mL-1的线性溶液,以水为稀释剂逐步稀释,分别在信噪比为3∶1和10∶1时作为检测限和定量限,测得NTTP的检测限和定量限分别为0.02 ng·mL-1和0.08 ng·mL-1。

2.3.7 提取效率考察取磷酸西格列汀原料药(批号：SGZ1040006)和磷酸西格列汀片(批号：T024447),分别按“2.1.2”项平行制备2份溶液,分别超声并振摇10、20 min,进样检测,按标准曲线法计算NTTP含量,计算得原料药2份供试品溶液中NTTP含量相对标对偏差为3.32%,片剂2份供试品溶液中NTTP含量相对标对偏差为2.02%,结果表明超声并振摇10 min可提取完全。

2.4 样品测定按“2.1”项下制备磷酸西格列汀供试品溶液,照“2.2”项下条件进样检测,记录色谱图(典型图谱见图2B、C),以峰面积按标准曲线法计算供试品溶液中NTTP的含量。4家原料厂家的12批样品中检出NTTP含量为0.014～0.20 μg·g-1;有3批磷酸西格列汀片中检测出NTTP,含量为1.26～1.41 μg·g-1。

3 讨论

NTTP在水中易溶,以水为溶剂配制浓度约为1 μg·mL-1的对照品溶液,分别采用ESI离子源和APCI离子源下针泵进样对NTTP的响应及定量/定性离子进行考察,结果表明NTTP在ESI离子源正离子采集模式下响应更好,继续对ESI+条件进行优化,最终确定NTTP定量离子对为m/z 221.83→191.95,锥孔电压为10 V,碰撞能量为10 eV,定性离子对为m/z 221.83→164.71作为,锥孔电压为10 V,碰撞能量为20 eV。

以水为溶剂配制含磷酸西格列汀和NTTP浓度均约为100 μg·mL-1的混合溶液,采用紫外检测器对NTTP峰与西格列汀峰之间的分离情况进行了考察,分别试验了甲醇-水、乙腈-水系统,试验证明当流动相为乙腈-水时NTTP和西格列汀出峰较快,且可完全分离,水中加入甲酸铵后NTTP的质谱响应降低明显且峰型变差,加入甲酸可以增强离子化效率提高质谱响应。最终以含0.1%甲酸的水溶液为流动相A,0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B,并进行梯度洗脱。在最终确定的色谱条件下,磷酸西格列汀在2.2 min即可洗脱完全,质谱采集时间设定为2.3～8.0 min,高浓度的磷酸西格列汀经液相洗脱后直接从废液排出,以避免对质谱的污染。

磷酸西格列汀片未明确最大单日剂量,按推荐剂量100 mg·d-1计;EMA和FDA最初都将NTTP最大摄入量设定为37 ng·d-1,但FDA为了避免西格列汀产品的短缺,将NTTP最大摄入量调整为246.7 ng·d-1[15];如按37 ng·d-1计算,则磷酸西格列汀中NTTP的残留限度为0.37 μg·g-1,所检原料药中NTTP均未超过此限度,但片剂中NTTP含量已超限度值;如按246.7 ng·d-1计算,则磷酸西格列汀中NTTP的残留限度为2.47 μg·g-1,原料药和片剂中NTTP均未超出此限度。片剂中NTTP含量显著高于原料药,可能是由于终产品中的TTP残留继续与极微量的亚硝酸盐继续反应生产NTTP,关于TTP残留量与NTTP残留量之间的相关性还需进行进一步的研究。