原发性卵巢发育不全一家系HROB致病等位基因遗传学分析

吴兴汉，彭湘云，郑宇，张树菊，彭聿，王华

1.湖南省儿童医院医学遗传科，湖南 长沙 410007

2.湖南省儿童医院内分泌科，湖南 长沙 410007

POI 是指女性40 岁之前卵巢滤泡减退或功能障碍伴闭经，早先称为原发闭经或卵巢早衰［1］，特征是卵泡刺激素水平超过25 IU/L 及雌二醇水平低下［2］。POI 的病因具有高度异质性，可由自身免疫性疾病、感染或医源性因素诱发，也可由自发性遗传缺陷引起［3］，最常见的遗传病因为X染色单体或X 染色体结构异常导致，亦可由单基因变异导致。

在哺乳动物中，通过同源重组进行DNA 修复对于基因组完整性、肿瘤抑制和配子形成至关重要［4］。HROB 是一种参与同源重组的含寡糖结合结构域的折叠因子，通过将MCM8-MCM9 解旋酶募集到DNA 损伤位点以促进DNA 合成而起作用。研究发现，雌性Hrob突变小鼠及纯合敲除的小鼠可表现出卵母细胞缺乏从而导致不孕［5］。但HROB基因变异在OMIM 人类疾病表型数据库尚未收录，且在中国人群中尚未见报道。本研究报道了一原发性卵巢发育不良家系的临床特征及遗传学检测结果，鉴定了2 个新的HROB致病等位基因。本研究通过湖南省儿童医院伦理委员会审查（KYAQ2022-263），所有检查均获得患儿监护人知情同意。

1 病历摘要

患儿女性，13 岁6 个月，因“月经未初潮”于2023 年4 月19 日就诊于湖南省儿童医院医学遗传科。患儿第二性征未发育，出生后身高较同龄儿落后，现身高146 cm，小于同性别同龄儿身高第3 百分位，骨龄相当于11 岁。实验室检查结果显示，卵泡刺激素74.99 mIU/mL，黄体生成素27.10 mIU/mL，抗米勒管激素0.01 ng/mL，外周血细胞核型分析结果为46，XX，排除特纳综合征；盆腔超声提示膀胱后方长条形低回声区：子宫声像？双侧卵巢显示不清（表1、图1A）。先证者妹妹11 岁5 个月，月经未初潮，身高145 cm，处于同性别同龄儿身高第25 百分位，实验室检查及影像学检查结果与先证者相似（表1、图1B）。先证者弟弟9 岁，发育与同龄儿相仿。家系图谱见图2。

图1 本例原发性卵巢发育不全先证者及其妹妹子宫超声影像Figure 1 Ultrasound findings of the uterus in the proband of primary ovarian insufficiency and her younger sister

图2 本例原发性卵巢发育不全先证者的家系图谱Figure 2 Genealogy atlas of the proband of primary ovarian insufficiency

表1 本例原发性卵巢发育不全先证者及其妹妹的表型特征Table 1 Phenotypic characteristics of the proband of primary ovarian insufficiency and her younger sister

先证者予起始剂量0.125 mg/d 戊酸雌二醇口服以诱导青春期和第二性征发育，半年后第二性征开始发育；先证者妹妹骨骺暂未闭合，暂未予雌激素治疗。

2 遗传学检测结果

提取先证者及父母送检样本的基因组DNA，经片段化、连接接头、扩增纯化后，使用杂交捕获方法制备DNA 文库，采用美国IDT 公司xGen®Exome Research Panel v2.0 全外显子捕获芯片捕获基因组区域外显子后，在Illumina HiSeq X Ten平台上对捕获的DNA 文库进行测序，读数为150 bp 的配对端。将测序数据与人类基因组hg19（GRCh37）参考序列进行比对，并对目标区域的覆盖度和测序质量进行评估。

对全外显子组测序及数据分析获得的候选基因HROB进行测序验证。通过在线引物设计软件NCBI-Primer-BLAST 进行引物设计。对聚合酶链反应扩增产物用天根纯化试剂盒纯化后，用ABI-3500DX测序仪（美国ABI公司）进行上机测序，应用SeqMan 软件进行比对分析测试数据。桑格测序引物序列如下：HROB-c.718C＞T-F1：TGGATTG GCAATCAGAGAAGAGT；HROB-c.718C＞T-R1：GCT GACAAGGGAAACGATTTTGA；HROB-c.1351C＞T-F1：TGTACTACAGTTTTTCCGAGGGG；HROBc.1351C＞T-R1：GATATGTTGGCACATGTACTGGC。

通过全外显子组测序和桑格测序，在先证者及其妹妹的外周血中均检测出HROB基因NM_001171251.3：c.718C＞T（p.Arg240*）及c.1351C＞T（p.Arg451*）复合杂合变异，240 号和451 号氨基酸产生终止密码子，导致蛋白编码提前截短，该基因位于17q21.31 区域，分别遗传自杂合携带的父亲和母亲，与常染色体隐性遗传模式相符。先证者弟弟桑格测序验证提示杂合携带父源变异位点c.718C＞T（p.Arg240*），未携带母源变异位点。见图3。

图3 本例原发性卵巢发育不全先证者及家系桑格测序图Figure 3 Sanger sequencing diagram of the proband and her family members

因HROB基因c.718C＞T（p.Arg240*）变异未曾报道，其在gnomAD中频率为0，纯合子频率为0，可使用PM2_supporting证据；c.1351C＞T（p.Arg451*）变异在gnomAD中频率为0.000001368，纯合子频率为0，可使用PM2_supporting 证据。虽OMIM 数据库未关联表型，但有数篇文献报道HROB基因与POI或小鼠生殖细胞丢失相关［5-7］，可使用PP4 证据。且既往已报道的病例均为截短变异（功能丧失），本研究中两个变异导致的蛋白截短均大于10%，可以使用PVS1证据。综上，两个变异位点均可评级为疑似致病（PM2_supporting+PP4+PVS1）。

3 讨论

不孕不育是一个越来越受到重视的公共卫生问题，影响着全世界10%的夫妇［7］。POI 是女性不孕症常见的综合征之一，影响约3.7%的40岁以下女性，还可导致骨质疏松症、心血管疾病、神经系统退行性疾病等并发症，甚至缩短寿命［8］。人类女性的卵泡发生及卵子成熟依赖于减数分裂和有丝分裂的正常进行，而同源重组中DNA损伤修复的相关基因（XRCC2、MCM8、MCM9等）变异可导致POI相关综合征。

在减数分裂Ⅰ期，当DNA 双链发生断裂时，同源重组开始启动［9］。首先通过核酸外切酶处理双链发生断裂的DNA 末端生成3'单链DNA，由此产生的悬垂部分被重组酶RAD51 包被形成核蛋白丝，侵入完整的姐妹染色单体，寻找同源序列。RAD51 包被的单链DNA 与供体链（称为突触）的配对导致与供体互补的链位移（形成称为“D 环”的结构），并建立RAD51 结合的异质双链，从而启动DNA 修复合成［10］。Hustedt等［5］通过体外功能实验证明，解旋酶HELQ 和HROB-MCM8-MCM9 解旋酶复合物构成了RAD51 核蛋白丝下游的两个平行途径。HROB 与复制蛋白A 复合体和MCM8-MCM9 复合体相互作用，促进MCM8-MCM9 定位到同源重组位点从而促进DNA 修复合成。OMIM 数据库和文献报道显示，MCM8基因的常染色体隐性致病变异可导致POI 和基因组不稳定性增加［11］。

动物研究显示，促排后Hrob纯合移码突变的小鼠不产生任何卵母细胞，镜检也未见卵泡，而野生型雌性小鼠可正常获得卵母细胞，并且所有Hrob纯合移码突变的雌鼠表现出子宫发育不良和卵巢异常小；与野生型雄性小鼠比较，Hrob纯合移码突变的雄鼠表现出较小睾丸，病理检查发现其生精小管较细且无精子［5］。Hrob纯合移 码突变 的表型 与Lutzmann等［12］报道的Mcm8基因敲除小鼠模型相似，均表现为两性生殖细胞的丢失。HROB-MCM8-MCM9 解旋酶复合物共同参与DNA 损伤修复，但至今OMIM 数据库仍未收录人类HROB基因变异的疾病表型。

Tucker等［6］报道了1 例孤立性的POI 女性患者携带HROB基因c.421delG（p.Glu141ArgfsTer62）纯合变异，表现为卵巢发育不全、第二性征未发育、卵泡刺激素增高。另外一个大型卵巢早衰队列研究显示，来自土耳其一家系2 例女性患者系HROB基因c.502delG（p.Glu168 ArgfsTer35）变异纯合子，表现出条索状子宫和原发闭经［7］。本文资料中的家系患者卵巢发育不全临床表现与其一致。但上述研究均未报道身材矮小表现，而本文资料先证者身材矮小，妹妹目前身高也偏矮小。HROB基因编码647 个氨基酸残基的蛋白质，在人类细胞中广泛表达。该蛋白包含PRR18 和高度保守的OB-fold。文献报道的患者与本文资料中的患者变异位点均处于HROB基因的3号外显子，并且均为功能丧失型变异，导致全部或部分PRR18 区域及OB-fold 结构域发生截短缺失（图4）［6-7］。已有文献报道，HROB 的OB-fold结构域不参与DNA 结合，可能是通过在DNA 展开过程中协调MCM8-9 环的结构转变，在DNA 组装的下游以刺激特异性易位使DNA 展开［13］。然而HROB 中DNA 结合域的功能仍然未知，包含PRR18区域的3号外显子是否发挥了功能尚需进一步实验证实。

图4 HROB基因变异位点及可能的结构域Figure 4 HROB gene variant loci and possible domain

研究者还发现，与健康个体比较，携带HROB变异患者外周血染色体核型中断裂染色体数增加；在携带HROB变异患者外周血加入丝裂霉素，其染色体断裂比例与范科尼贫血患者接近［7］。然而，本文所述病例和文献报道［7］的患者均无范科尼贫血的表现（贫血、癌症、小头畸形、牛奶咖啡斑等）。这种染色体脆性可能导致恶性肿瘤风险增加，因此HROB基因变异是否导致范科尼贫血的症状，仍需要多学科团队对患者进行长期随访。本文资料中，先证者予起始剂量0.125 mg/d戊酸雌二醇口服［14］以诱导青春期和第二性征发育。因患者HROB基因复合杂合变异影响DNA损伤修复，可能诱发肿瘤风险增高，暂不推荐使用生长激素治疗促进身高增长。

综上，本文资料患儿是由HROB基因复合杂合变异导致的原发性卵巢发育不全，本研究鉴定了导致原发性卵巢发育不全的两个新的等位基因，丰富了HROB的突变谱，为后续进一步研究HROB 蛋白中DNA 结合域的功能奠定了基础，也为POI患者的病因学诊断提供了新思路。

志谢研究得到湖南省遗传性出生缺陷与罕见病临床研究中心建设项目（2023S-K4053）支持

AcknowledgementsThis work was supported by Hereditary Birth Defects and Rare Disease Clinical Research Center Construction Project of Hunan Province (2023S-K4053)

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

©The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)