六例KIF1A基因变异相关常染色体显性遗传神经发育障碍患儿临床和遗传学分析

林静琦，李牛，姚如恩，郁婷婷，王秀敏，王剑

1.上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院中心实验室，上海 200030

2.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心遗传分子诊断科，上海 200127

3.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心内分泌代谢科，上海 200127

KIF1A基因位于2 号染色体q37.3 区域，编码一种神经元特异性ATP 依赖驱动蛋白；因可介导神经轴突运输囊泡、细胞器和蛋白质复合物等，其对神经元功能至关重要［1］。目前已知KIF1A基因变异可导致多种神经系统疾病，包括常染色体显性遗传发病的NESCAVS（OMIM#614255）、常染色体显性或隐性遗传发病的SPG30（OMIM#610357）以及常染色体隐性遗传发病的HSN2C（OMIM#614213）。NESCAVS 是一种早发型儿童神经退行性疾病，通常表现为全面发育迟缓，一方面是主要影响下肢的进行性痉挛所引起的行走困难，并可能导致独立行走能力的丧失，另一方面是不同程度的智力发育迟缓、语言迟缓、学习障碍和/或行为异常；受累患者还可能合并皮质性视觉障碍、视神经萎缩、轴突周围神经病变、癫痫发作、自主神经障碍、共济失调和肌张力障碍等［2］。SPG30 则主要表现为双侧下肢痉挛和无力，伴有下肢反射亢进，下肢进行性僵硬和收缩，在部分复杂病例中还可能伴有其他神经系统异常，如癫痫发作、智力障碍和周围神经病变等一系列异常［3］。而HSN2C 的特征是在儿童期进行性远端感觉丧失，导致手指和脚趾溃疡和截肢，患者还会出现远端肌肉无力，主要影响下肢［4］。

目前，国内数据库中检索到3例KIF1A基因变异相关病例报道［5-7］，患者表型不一。本研究对收治的6例KIF1A基因变异神经发育障碍患儿的临床特征及基因型进行分析，以期拓展这类疾病的基因谱和表型谱，并提高临床医生对这类疾病的认知。

1 对象和方法

1.1 对象

回顾性分析2018—2020 年在上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心就诊的6例KIF1A基因变异患儿的临床及基因检测资料。6例均为临床发病并寻求鉴定遗传学病因患儿，其中男性4例，女性2例，确诊年龄7月龄～18岁。本研究通过上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心伦理委员会审查（SCMCIRB-K2020060-1），所有检查均获得患儿父母知情同意。

1.2 仪器及试剂

SureSelect XT Human All Exon V6 试剂盒为美国Agilent 公司产品；M220 核酸打断仪为美国Covaris 公司产品；NovaSeq 6000 测序仪为美国Illumina公司产品；ABI 3500测序仪为美国ABI公司产品。

1.3 全外显子组基因测序检查基因变异

使用M220 核酸打断仪将先证者基因组DNA打断成150～200 bp 大小的片段，采用SureSelect XT Human All Exon V6 试剂盒进行外显子组文库构建及捕获，NovaSeq 6000 测序仪进行高通量测序。利用美国SoftGenetics 公司NextGENe®软件将测序数据与参考基因组（Human 37.3，SNP135）进行匹配比对，并使用上海闪译生物科技有限公司TGexTM软件分析基因变异；使用ABI 3500 测序仪对先证者及其家系成员对鉴定到的KIF1A基因变异进行桑格测序验证。

1.4 生物信息学分析蛋白质三维结构和变异的致病性

基于PDB 数据库KIF1A 运动结构域的晶体结构（https：//www.rcsb.org/structure/2ZFI），采用Swiss model（https：//swissmodel.expasy.org/）软 件对变异序列进行建模，并使用分子可视化软件PyMOL（https：//pymol.org/）生成KIF1A 野生型蛋白质和变异体的三维结构图像。通过mCSM［8］（http：//biosig.unimelb.edu.au/mcsm/）、SAAFEC-SEQ［9］（http：//compbio.clemson.edu/SAAFEC-SEQ/index.php）和MUpro［10］（http：//mupro.proteomics.ics.uci.edu/）工具分析蛋白质稳定性的变化。分别采用REVEL软件［11］和Splice AI 软件［12］对错义突变和剪接突变的有害性进行评估，使用ACMG 联合美国分子病理学协会颁布的遗传变异分类标准与指南［13］对变异进行致病性分析。

2 结果

2.1 临床特征

6 例患儿的临床特征总结见表1。所有患儿均有不同程度的运动发育迟缓，其中4 例会走路的患儿存在步态异常或易摔倒，例1尚不能独坐，例2仍坐不稳且不会走路；3例患儿同时合并智力发育迟缓。例1 和例2 同时存在目不追物以及癫痫或痉挛发作，而其余4 例暂未出现此类临床异常。2例患儿存在肌张力异常，其中例2双侧肢体肌张力增高，例5下肢肌张力增高。3例有头颅核磁共振记录的患儿中，仅例2 存在两侧小脑半球脑沟裂增宽加深。6例患儿的血尿串联质谱检测均未见异常。所有患儿父母未见相关临床表现。

表1 6例KIF1A基因变异患儿临床特征一览Table 1 Clinical characteristics of 6 patients with variants in the KIF1A gene

2.2 基因检测结果

6 例患儿共检测到5个KIF1A基因杂合变异（NM_001244008.2），均未在gnomAD 对照数据库（http：//gnomad.broadinstitute.org/）收录。其中2例患儿检出c.296C＞T（p.T99M）错义突变，为KIF1A基因热点突变；1 例患儿检测到c.761G＞A（p.R254Q）错义突变，亦有报道。其余3例患儿分别携带c.326G＞T（p.G109V）错义突变、c.745C＞G（p.L249V）错义突变和c.798+1G＞A 剪接突变（图1），均未曾报道。桑格测序显示6 例患儿的父母KIF1A基因均为正常野生型，提示所检测到的变异均为新生突变（De novo）。结合临床表型和基因检测结果，6 例患儿均诊断为KIF1A基因变异导致的常染色体显性遗传神经发育障碍。

图1 3个KIF1A基因新发变异的桑格测序结果Figure 1 Sanger sequencing results of the three novel variants of KIF1A gene

2.3 KIF1A变异致病性分析

对首次报道的两个错义突变对应的蛋白质（G109V和L249V）进行三维建模分析发现，109 位的甘氨酸（G）突变为缬氨酸（V）后，将导致其与115 位的谷氨酰胺之间的氢键消失（图2A）；249 位的亮氨酸（L）突变为缬氨酸（V）后，会与218位的组氨酸形成一个新的氢键，并导致其与95位的丙氨酸之间的三个氢键消失两个（图2B）。通过比较变异体和野生型蛋白之间自由能变化的差值（ΔΔG）发现，G109V、L249V和R254Q变异均表现出蛋白稳定性下降（表2）；虽然T99M 在不同工具ΔΔG 值预测上存在差异，但已有功能研究显示该变异削弱了蛋白质定位于神经突起远端的能力。此外，REVEL 软件评估表明4 个错义突变均为有害性变异（表2）。根据美国ACMG指南，c.296C＞T为“致病”，其余3个错义突变为“可能致病”。

图2 KIF1A蛋白新发错义突变的三维分子结构建模Figure 2 The three-dimensional structure of the novel missense mutations of KIF1A protein

表2 KIF1A基因错义突变的致病性分析Table 2 Pathogenicity analysis of the missense mutations in KIF1A

c.798+1G＞A 剪接突变位于14 号内含子第一个碱基位置，Splice AI软件预测可能导致KIF1A基因信使RNA剪接成熟过程中15号外显子跳跃，并因此丢失66 个碱基（c.799_864 del），从而导致22个氨基酸的阅读框内整码缺失（p.267_288 del）；三维建模分析表明该段氨基酸缺失将导致KIF1A蛋白运动结构域中一个α 螺旋结构的严重受损（图3）。根据美国ACMG 指南，c.798+1G＞A 被判定为“可能致病”。

图3 KIF1A 蛋白新发剪接突变可能导致的氨基酸缺失Figure 3 The three-dimensional structure of the novel splicing variant of KIF1A protein

3 讨论

既往国内已报道的KIF1A基因变异患者中，许钢等［5］报道的c.110T＞C（p.I37T）杂合新生突变患儿双下肢无力且力量逐年减弱、步态异常、下肢肌张力增高，诊断为SPG30；黄延等［6］报道的c.664A＞C（p.N222H）新生突变患儿智力语言发育迟缓、社交困难，诊断为孤独症谱系障碍；沈茹等［7］报道的c.914C＞T（p.P305L）杂合新生突变患儿智力语言发育迟缓、走路不稳易摔倒、双侧足内翻，看人时双眼角膜向上、外斜视，头颅核磁共振显示双侧小脑半球体积减小、脑沟增宽加深，诊断为NESCAVS。本文表1的6例患儿中，例1、2 和4 符合NESCAVS 临床诊断，而例3、5 和6 临床特征更倾向SPG30。虽然国内报道例数有限，但仍可见KIF1A基因变异所致临床表型的复杂性。

基于KIF1A基因变异引起的临床表型异质性较强，且NESCAVS、SPG30 和HSN2C 的表型互有重叠，临床难以作出精准分型，近年来已有文献将其统一归类为KIF1A基因相关神经系统疾病［14］。有学者建议根据基因型（以表型作为参考）对KIF1A基因变异病例进行分类，而不是传统的根据表型（以基因型作为参考）分类的模式；即将重点放在患者变异位点和特定表型上，而不是单纯型或复杂型综合征的诊断上［15］。这一分类依据已在部分变异位点得以验证，如p.S58L、p.T99M、p.E253K 和p.T258M 变异的患者往往行走困难且伴有癫痫，而p.S69L、p.A255V、p.R350G等变异的患者主要表现为痉挛性截瘫［14］。

KIF1A 蛋白包含由氨基端第1～361 个氨基酸残基构成的运动结构域、第516～572 个氨基酸残基构成的叉头相关蛋白结构域和第1676～1774个氨基酸残基构成的普列克底物蛋白同源结构域［16］。KIF1A 通过羧基端的普列克底物蛋白同源结构域高亲和力且特异性结合脂质囊泡中的磷脂酰肌醇，氨基端的运动结构域通过其下游的卷曲螺旋相互作用形成二聚体，利用ATP 的水解作为能量来源，将物质从细胞体沿微管运送到神经元外周末梢［17］。KIF1A 蛋白对神经发育至关重要，其在脑和脊髓中呈高表达［18］；研究表明，KIF1A蛋白可调节小鼠海马区突触的发生和学习增强［19］，Kif1a缺失小鼠表现出严重的运动和感觉障碍，并在出生后1 d 左右死亡［20］。本研究鉴定的变异均发生在KIF1A 蛋白的运动结构域中，可能阻碍了驱动蛋白与微管的正确结合，导致其沿轴突的运动能力受损［21］。

c.296C＞T（p.T99M）是KIF1A热点突变，此前已有至少9 例病例报道［16，21-25］。与本研究纳入的2例患儿类似，受累患者往往表型较为严重，存在中度到极重度不等的智力障碍和发育迟缓，大多丧失行走能力，出现痉挛或癫痫症状，多有眼部异常如视神经病变或萎缩，部分患者还可合并小头畸形。Thr99 位于KIF1A 运动结构域高度保守的p 环共识ATP 结合位点，在原代大鼠海马神经元中的实验显示，与野生型比较，T99M 变异的KIF1A 远端定位大大减少，整个细胞体和近端神经元的聚集增加［22］。R254Q变异已在2例病例中报道，分别为一例8 岁男童（5 岁起病）［26］和一例5岁女童（2～3岁起病）［27］。与本研究中携带R254Q变异的患儿类似，3例患儿均症状较轻，尽管存在步态障碍，但能够独立行走，病程进展较慢。L249V 虽为本研究首次发现，但已有L249Q［21］和L249P［28］的病例报道，表型均比本研究中携带L249V 变异的患儿严重，除了共同存在的运动发育迟缓和痉挛，2 例已报道患儿还合并中等程度的智力障碍。此外，携带L249Q 变异的患儿行走需要辅助，伴有视神经萎缩；携带L249P变异的患儿存在痉挛性截瘫、全身性癫痫发作、眼震颤，兴趣有限、沟通不畅，并且小脑萎缩。已报道的c.798+1G＞T 患儿存在中度痉挛步态［27］，但与本研究中c.798+1G＞A 变异患儿仅有运动发育迟缓和步态异常表现明显不同的是，前者还存在兴趣有限、社交困难等类似自闭症谱系障碍的特征。可见KIF1A基因相同位置的不同变异可造成表型和严重程度的不同。

目前已鉴定到的KIF1A变异主要集中在运动结构域，且大部分源自散发病例；目前已报道的200 余例KIF1A基因变异患者中［2，15-16，27，29-30］，近70%为患儿自发新生突变。除上述少数变异位点外，大部分KIF1A基因变异尚未建立显著的基因型-临床表型关联，仍需积累更多病例数据观察。最近有假说提出了一种变异特异性的剂量效应：一些变异可能仅涉及远端轴突顺行运输的轻微损伤，导致较轻微的表型；而另一些变异可能损害近端轴突及其他神经元群体，导致严重的表型；少数已报道的功能丧失型变异会造成KIF1A 蛋白水平降低而导致运输减少［3］。然而即使是同一变异的患者也存在临床异质性，或许需要考虑其他驱动蛋白的补偿机制以及其他未知的遗传或环境因素。

综上所述，本研究总结分析了6例KIF1A基因变异致神经发育障碍患儿，扩大了KIF1A基因变异相关疾病的基因型和临床表型谱，为患者的临床诊断和家系生殖遗传咨询提供了依据。

志谢研究得到国家重点研发计划（2020YFA0804001）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the National Key R&D Program of China (2020YFA0804001)

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

©The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)