新生儿筛查确诊苯丙氨酸羟化酶缺乏症患者基因变异及长期随访分析

孙萌，李育霖，李盼盼，李改杰，闫 妍，邹卉

济南市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心，山东 济南 250001

HPA 是由于PAH 缺乏或其辅酶四氢生物蝶呤缺乏导致血Phe浓度持续增高的一组最常见的氨基酸代谢病，呈常染色体隐性遗传，如未早期治疗会造成患者智力发育不可逆损害［1］。中国HPA 新生儿筛查起始于20 世纪80 年代，是我国最早进行的新生儿疾病筛查病种之一［2］。PAH缺乏症患者随着年龄增长，陆续进入青少年及成人患者时期，后者治疗随访重点与婴幼儿时期有所不同。本研究通过分析268 例PAH 缺乏症患者的基因检测结果及本中心新生儿疾病筛查确诊的198 例PAH 缺乏症患者的长期随访资料，旨在了解PAH基因变异类型以及学龄期前儿童及青少年PAH缺乏症患者的预后转归情况。

1 对象与方法

1.1 对象

收集1996 至2021 年济南市新生儿疾病筛查中心筛查确诊的198例PAH缺乏症患者及济南周边地区转诊经筛查确诊的213例PAH缺乏症患者的临床资料。根据《高苯丙氨酸血症的诊治共识》［3］，411例患者中经典型PKU 200例、轻度PKU 116例、轻度HPA 95例。本中心自2010年进行确诊患者的基因检测，411例患者中共268例经父母签署知情同意书后行基因检测。其中本中心新生儿筛查确诊55 例、济南周边地区转诊213 例。本研究通过济南市妇幼保健院伦理委员会审查（2022-1-006），标本检测经过新生儿监护人知情同意。

1.2 仪器及试剂

串联四级杆质谱仪TQD-1525 为美国Waters公司产品；时间分辨荧光免疫分析仪VICTOR2-1420 为芬兰Wallac 公司产品；二代测序平台DNBSEQ-T7 为华大基因公司产品；桑格测序仪3730XL为美国ABI公司产品；DNA提取纯化试剂盒为杭州博日科技股份有限公司产品；非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒及Phe测定试剂盒为美国PerkinElmer公司产品。

1.3 定制Panel检测基因变异

采集患者及父母的外周血送至第三方检测实验室，提取受检者提供的检测标本中的基因组DNA。采用定制PAH、PTS、PCBD1、QDPR、SPR、GCH1等86 个遗传代谢病相关基因的捕获探针，通过多重探针杂交方法靶向富集目标区域序列，经高通量测序技术进行测序。对发现一处变异的标本再采用多重连接探针扩增技术进行拷贝数异常变异的检测。通过桑格测序对明确变异位点的患者的父母进行基因验证确定变异来源。

1.4 198例患者的治疗及随访方法

筛查确诊后，轻度HPA 患者正常饮食，轻度PKU 及经典型PKU 患者给予低Phe 饮食治疗，根据个体差异，遵循个体化治疗原则。但后者中有两例患儿因家属未同意而未于确诊后接受治疗，至出现临床症状才接受治疗，治疗时间分别为7 月龄和8 月龄。随访过程中监测患者血Phe 浓度，1 岁以下1 周测一次，1～12 岁2 周～1 个月测一次，12岁以上1～3个月测一次，每3～6个月测量患者身高、体重。采用0～6 岁儿童神经心理发育量表对0～6 岁患者于1、2、3、6 岁时进行大运动、精细动作、适应能力、语言、社会行为五大能区的智能发育评估［4］。对6 岁以上患者记录学习成绩。对14岁以上患者完成颅脑MRI。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0 软件对数据资料进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因变异检测结果

完善基因检测的268 例PAH 缺乏症患者中，253 例检测到两个及以上来自父母双方的变异位点；15 例仅检测到1 个变异位点，均为致病变异。共检出111 种变异，其中以c.728G＞A（16.50%）、c.158G＞A（8.35%）、c.721C＞T（5.70%）、c.1068C＞A（5.31%）、c.611A＞G（7.40%）变异多见。共检出12 例患者携带纯合致病变异，其中c.728G＞A 纯合变异7 例，均为经典型PKU。共检出44 例患者携带c.158G＞A 复合杂合变异，其中以轻度HPA患者为主（37 例）。携带c.158G＞A 变异的经典型PKU（5 例）和轻度PKU（2 例）患者中，携带3 个基因变异位点5 例，其中4 例同时出现c.842+2T＞A变异，且该变异未在上述37例轻度HPA患者中出现；2例分别是与c.799C＞T或c.1199G＞C组成的复合杂合变异，均为经典型PKU。结果提示，PAH基因以c.728G＞A、c.158G＞A、c.611A＞G、c.721C＞T、c.1068C＞A 变异多见，其中c.158G＞A 复合杂合变异的临床表型以轻度HPA 为主，但在经典型PKU和轻度PKU中也均有分布。

2.2 198例患者转归结果

198例PAH缺乏症确诊患者中，5例PKU患者放弃治疗，9例PKU患者因其他疾病死亡，26例轻度HPA 患者无须治疗。共168 例患者接受随访，末次随访年龄5月龄～22岁，随访时间（9.43±5.83）年。168 例患者体格发育均正常，无矮小及营养不良发生，见表1。结果提示，PAH 缺乏症患者经规范治疗后体格发育良好。

表1 168例PAH缺乏症患者的身高、体重分布情况Table 1 Height and weight distribution of 168 patients with PAH deficiency

168 例患者中6 岁及以下共67 例，其中33 例患者完善神经心理发育量表资料，并按照末次随访年龄分为两组：3岁及以下组（n=15）和3～6岁组（n=18）。33例患者中，智能发育异常2例，其初始治疗年龄均超过6 月龄，且均为3～6 岁组；其余31 例智能发育均在正常水平。3～6 岁组患者血Phe 浓度显著高于3岁及以下组［分别为（299.68±140.02）和（154.88±43.84）μmol/L，P＜0.05］，3～6岁组和3岁及以下组患者的发育商差异无统计学意义［分别为（92.69±15.51）和（98.39±9.45）分，P＞0.05］。对6岁以上PAH 缺乏症患者（n=101）学习情况进行随访，均于普通学校就读，93 例中小学阶段患者学习成绩中等及以上，8 例已上大学。结果提示，PAH 缺乏症患者经过早期干预、规范治疗，智能发育可达正常水平。

22 例14 岁以上患者中，完成MRI 检测9 例，其中经典型PKU 8 例、轻度PKU1 例，平均年龄（17.13±2.42）岁。1例经典型PKU患者结果正常；其余8 例发现脑内多发异常信号，即均有T2WI 上双侧侧脑室旁小斑片状或片状高信号灶表现，多见T2WI上半卵圆中心斑点状或片状高信号灶，还可见T2WI 上顶枕叶、胼胝体压部、左侧放射冠区及右侧丘脑高信号灶。该例结果正常患者的血Phe 浓度控制在360 μmol/L 以内。9 例患者智能发育正常，社会适应良好，其中3 例已上大学，其余6 例学习成绩中等及以上。结果提示，即使MRI 结果存在差异，早期干预的患者智能发育和社会适应能力均良好。

3 讨论

PAH 缺乏症由PAH基因缺陷导致，不同种族、不同地域之间基因变异的类型、频率分布呈现多样性［5］。在东欧国家PAH基因变异类型中，c.1222C＞T 最常见，而欧洲南部以c.782G＞A 最常见，而中国人群常见的变异位点有c.721C＞T、c.728G＞A［6-7］。PAH 缺乏症不同基因型所致临床表型存在差异。复合杂合基因型的表型相对复杂，不同变异单体间可能相互影响，多数取决于两个变异位点中较温和的变异位点［8］。c.158G＞A的残余酶活性为79%，本研究中携带该位点的复合杂合患者主要为轻度HPA，亦存在轻度甚至经典型PKU，与Tao等［9］报道一致。有学者通过对120 种变异在蛋白质三维结构的位置、临床表型及变异的体外酶活性进行分析，发现蛋白质不同功能域的变异对临床表型的影响不同［10］。还有学者发现，改变基因变异的诱导表达温度，蛋白质表达量及酶活性也会发生改变，因此相同基因型所致临床表型可能存在差异［11］。这也解释了本文资料中2 例携带相同的c.158G＞A 和1199G＞C 复合杂合基因型患者分别表现为经典型PKU 及轻度HPA。作为发病率最高的氨基酸代谢病，PAH 缺乏症的基因诊断可以构建本地域的基因突变热点，帮助临床医生判断患者的预后以及治疗中对Phe 的耐受力，同时为患者家庭的再发风险评估和生育计划等提供依据。

过高的血Phe浓度及其中间代谢产物对中枢神经系统产生毒性作用，使脑组织受到不可逆的损害，进而导致患者智能发育异常、生长迟缓等；早期诊断和积极采用低Phe 饮食可降低血Phe 浓度，避免或减少对神经系统的损害，绝大部分患者预后良好［12］。婴儿期饮食结构单一，血Phe 浓度容易控制。随着患者年龄的增长，各种天然食物逐步增加及儿童间食物分享机会增多，饮食结构发生变化，都会提高血Phe 浓度控制难度。国外研究发现，学龄期前患者血Phe 浓度控制在120～360 μmol/L 可避免脑功能损害，如能控制在120～240 μmol/L 则可更好地保证患者的智能发育水平［13-14］。《高苯丙氨酸血症诊治共识》指出，1 岁以下患者血Phe 浓度的理想范围为120～240 μmol/L，1～12 岁则为120～360 μmol/L［3］。本研究中3 岁以下组与3～6 岁组患者血Phe 控制浓度存在差异，但两组间智能发育无明显差异。这说明随着年龄增大可适当放宽对血Phe浓度的控制要求，血Phe 浓度控制在理想范围内时对智能发育水平的影响较小。研究表明，经过筛查确诊并早期治疗的PAH 缺乏症患者智能发育水平与初筛时的血Phe 浓度无相关性，而治疗延迟的患者70%～80%则会出现中重度智力低下［15-17］。本研究中2 例智能发育异常患儿初始治疗年龄均大于6月龄，考虑与其延迟治疗长期积聚的高Phe浓度相关。

随着生物医学模式的转变，人们关注的不仅是HPA 患者的存活率，而更加注重其生活质量。随访期间，6 岁以上患者学习能力与社会适应性均在正常范围，这些患者均在筛查后进行早期规范治疗，并进行定期监测，Phe浓度稳定控制在理想范围，实现新生儿筛查早期干预治疗从而避免患者智力损伤的预期效果。有研究报道，高水平、不稳定的血Phe 浓度会影响患者脑白质的完整性，应定期监测并控制血Phe 浓度［18］。本研究中MRI结果存在差异，患者多有脑白质受损，1例MRI 正常患者较其他8 例患者的血Phe 浓度控制更稳定，低浓度并且平稳的血Phe 水平可能有助于减少脑部病变范围。9 例患者智能发育均正常，社会适应良好，3 例已上大学，其余6 例学习成绩中等及以上。MRI 异常者需要后期关注监测是否出现震颤、共济失调、头痛、感觉障碍等表现。

PAH 缺乏症患者早期开始治疗并定期随访将血Phe 浓度控制在理想范围内，智能发育可达到正常水平。新生儿疾病筛查对PAH 缺乏症的早期诊断和治疗至关重要，但必须强调长期随访并接受正规治疗的重要性，最大限度地提高家长和患者的依从性，坚持规范治疗，避免智能发育落后。PAH 缺乏症患儿达青少年及成人后，建议坚持饮食治疗和规律随访，避免神经系统并发症出现。

志谢研究得到山东省自然科学基金（ZR2020MH334）、济南市科技计划（2022-2-124）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020MH 334),and Science and Technology Program of Jinan City(2022-2-124)

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

©The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)