浙江省1200万例新生儿先天性甲状腺功能减退症、高苯丙氨酸血症筛查结果分析

2024-01-09周朵杨茹莱黄新文黄晓磊毛华庆杨建滨赵正言

浙江大学学报（医学版） 2023年6期

周朵，杨茹莱，黄新文，黄晓磊，杨昕，毛华庆，杨建滨，赵正言

浙江大学医学院附属儿童医院遗传与代谢科国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，浙江杭州 310052

新生儿筛查是指在新生儿出生后采用快速、简便、敏感的方法检测体内某些异常代谢产物，以期在患儿尚未出现临床症状前早期诊断、早期治疗，避免各系统出现不可逆性损害，进而提高患儿的生活质量。作为三级预防措施之一，新生儿筛查在降低出生缺陷率、提高出生人口素质方面发挥着巨大的作用［1］。CH 和HPA 是导致儿童生长发育迟缓和智力障碍最常见的两种遗传代谢病。1999—2022 年，浙江省近1200 万新生儿接受了CH 和HPA 筛查，本文回顾性分析筛查结果，旨在了解新生儿CH、HPA 的筛查率、发病率、基因变异等情况，为完善新生儿筛查工作提供参考。

1 对象与方法

1.1 资料来源

收集1999 年9 月至2022 年12 月浙江省新生儿疾病筛查中心对11 922 318 名新生儿进行血TSH 及Phe检测的资料。本研究通过浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会审查（2018-IRB-077），筛查前家长均签署知情同意书。

1.2 采用荧光法检测血TSH浓度筛查CH

按照《新生儿疾病筛查技术规范》，新生儿出生满72 h 且充分哺乳6 次后，由专业医护人员采集足跟血滴于专用采血滤纸片上，阴干后送检。根据试剂盒操作说明对干血斑进行预处理，应用荧光法检测血TSH浓度，1999—2013年采用1420手动检测仪，2014—2022 年4 月采用1235 半自动检测仪，2022 年4 月后改为GSP 全自动检测仪。血TSH在9 μIU/mL及以上的新生儿为CH筛查阳性，召回复查并完善甲状腺功能检测。复查结果显示血TSH增加、FT4减少，则患儿诊断为CH。

1.3 采用荧光法或串联质谱法检测血Phe 浓度筛查HPA

1999—2008 年采用荧光法检测血Phe 浓度；2009 年起，如该新生儿递送为四病筛查，仍采用荧光法检测血Phe 浓度；如递送为二十九病筛查，则采用串联质谱法检测血Phe 浓度。血Phe浓度超过120 μmol/L和（或）血Phe 与Tyr 比值（Phe/Tyr）超过2.0为HPA筛查阳性，召回复查，结果仍异常者完善尿蝶呤谱、血二氢蝶啶还原酶活性及基因检测。

1.4 高通量测序和MassARRAY 技术检测基因变异

采用高通量测序和MassARRAY 技术对PAH、PTS、CH 相关基因的外显子及侧翼内含子进行检测，检测结果与1000 Genomes、ESP6500数据库、ExAC 数据库和GnomAD 数据库进行比对。使用SIFT、Provean、PolyPhen-2、Mutation Taster、FATHMM 和Human Splicing Finder 等在线软件进行预测，分析可疑变异位点对蛋白质结构和功能的影响以及是否会引起剪接改变。明确基因变异患儿的父母进一步行桑格测序，以确定变异来源。

2 结果

2.1 浙江省24年来新生儿筛查率变化

1999 年9 月至2022 年12 月，浙江省共出生13 333 929 名活产新生儿，筛查11 922 318 名，总筛查率为89.41%。筛查率由1999 年的6.46%提升至2022 年的100.00%，2008 年后筛查率均高于97%，2014 年后筛查率均在99%以上，2018 年后接近100%，见表1。结果提示，浙江省筛查率逐年提高，近五年维持在近100%的高水平。

表1 1999—2022 年度浙江省新生儿先天性甲状腺功能减退症和高苯丙氨酸血症筛查率统计Table 1 The screening rates of newborns for congenital hypothyroidism and hyper-phenylalaninemia in Zhejiang province during 1999 and 2022

2.2 浙江省24年来CH和HPA发病情况

浙江省1999—2022 年共确诊CH 患儿8924例，总发病率约为1/1336（确诊数/筛查数）。其中，暂时性CH 3203 例，占比35.9%；终身性CH 5721例，占比64.1%。浙江省各地市发病率1/1861～1/1002，其中衢州市的发病率最高（1/1002），嘉兴市最低（1/1861）。1999—2022年的发病率波动在1/2330～1/748，其中2021 年发病率最高（1/748），1999 年发病率最低（1/2330）。见表2。结果提示，1999—2022年浙江省CH 发病率呈上升趋势，其中衢州地区发病率相对较高。

1999—2022 年共确诊HPA 患儿563 例，其中cPKU患儿508例，BH4D患儿55例，总发病率约为1/21 176。浙江省各地市发病率1/36 781～1/15 900，其中舟山市发病率最高（1/15 900），丽水市最低（1/36 781）。1999—2022年各年份HPA发病率波动在1/43 908～1/11 648，其中1999 年发病率最高（1/11 648），2006 年发病率最低（1/43 908）。见表3。结果提示，1999—2022 年浙江省HPA 患儿以cPKU多见。

2.3 浙江省CH和PHA患儿基因检测结果

8924 例CH 患儿中97例（1.1%）进行了基因检测，其中纯合变异6 例，复合杂合变异60 例，杂合变异30 例，半合子1 例。508 例cPKU 患儿中250例（49.2%）进行了基因检测，其中纯合变异29例，复合杂合变异200 例，杂合变异21 例。55 例BH4D患儿中36例（65.5%）进行了基因检测，其中纯合变异7例，复合杂合变异26例，杂合变异3例。

2.3.1 CH 患儿基因检测结果 97 例CH 患儿检出DUOX2基因变异67 例，TG基因变异12例，TPO基因变异10例，TSHR基因变异9例，DUOXA2基因变异4 例，DUOX1基因变异2 例，GLIS3、IGSF1和PAX8基因各1 例，其中10 例CH 患儿发生双基因变异。DUOX2变异检出率最高达69%，检出44 种变异，其中c.3329G＞A（p.R1110Q）、c.1588A＞T（p.K530X）、c.2654G＞A（p.R885Q）和c.4027C＞T（p.L1343F）分别占18.2%、17.3%、6.4%和5.4%。TG检出14种变异，检出率为12.4%；TPO检出12 种变异，检出率为9.7%，其中c.2268dupT（p.E757X）是TPO基因最常见的变异，占39.0%；TSHR检出12 种变异，检出率为9.0%，其中c.1574T＞C（p.F525S）最常见，占20.0%；DUOXA2检出3 种变异，c.738C＞G（p.Y246X）占50.0%。见附表1。结果提示，CH 患儿最常见的基因变异为DUOX2基因，多为错义突变，热点突变位点为c.3329G＞A（p.R1110Q）。

2.3.2 HPA患儿基因检测结果 250例cPKU 患儿检出81种PAH基因变异，包括47 种错义突变（58.0%）、13 种无义突变（16.0%）、12 个剪接突变（14.8%）、4 种框移突变、2 种整码突变、1 种复杂突变、1 种5'非翻译区大片段缺失，1 个4～7 号外显子缺失。各变异在PAH中分布不均，在外显子中发现68个（84.0%）变异，其中外显子7 中有15个（18.5%），外显子12 中有9个（11.1%），外显子11 和外显子6 各有7个（8.6%）。PAH基因最常见变异为c728G＞A（p.R243Q）、c.721C＞T（p.R241C）、c.611A＞G（p.Y204C）、c.442-1G＞A、c.331C＞T（p.R111*）和c.1068C＞A（p.Y356*）分别占24.4%、15.0%、8.1%、5.6%、5.0%和4.4%，外显子7为PAH基因变异的热点区域。发现7种PAH基因新发变异，分别为：c.107C＞A（p.S36*）、c.137G＞T（p.G46V）、c.148A＞G（p.K50E）、c.285C＞T（p.I95I）、c.843-10delTTCC、exon4-7del和c.1066-2A＞G。

36 例BH4D 患者中检出12种PTS基因变异，包括8种错义突变、3种剪接突变。PTS基因最常见变异为c.259C＞T（p.P87S），占31.9%；其次为c.84-291A＞G、c.155A＞G（p.N52S），分别占14.5%、10.1%，见附表2。

以上结果提示，浙江省PAH 基因变异多为错义突变，热点突变位点为c728G＞A（p.R243Q），检出7种PAH基因新发变异；PTS基因热点突变位点为c.259C＞T（p.P87S）。

3 讨论

浙江省新生儿筛查工作自1998年开展以来，筛查质量不断提高［2］，筛查率逐年升高，2014 年后已达99%以上，高于全国同期水平［3］，这与建立了覆盖全省的“健康宣传-采血-递送-检验-确诊-治疗-随访”为一体的“相对集中筛查、分级管理”的筛查体系及政府实行免费筛查政策相关［4］。

CH 是因先天因素使甲状腺发育异常引起甲状腺激素分泌不足或合成障碍，导致生长发育迟缓和智力障碍等后果的一种疾病，是儿童最常见的内分泌疾病之一，全球范围发病率为1/4000～1/1400，近年来其发病率呈快速上升趋势［5-6］。本文资料显示，1999—2022 年浙江省新生儿筛查共确诊8924 例CH 患儿，总发病率为1/1336，高于全国发病率。研究报道CH 发病率增高潜在的原因可能与人口统计学的变化、TSH 召回值降低（每降低1 mIU/L，CH 发病率增加2.96%）、早产儿存活率增加、筛查覆盖率增高和母亲甲状腺功能、年龄、孕期有机氯暴露有关［7-9］。浙江省新生儿筛查CH 发病率较高可能与以下原因相关：①浙江省积极推进样本信息化物流质控项目，采用专用医疗冷链将标本从采血机构直接送至省筛查中心实验室，安全、快速并最大程度保证了标本质量；②检测方法不断改进，具有更高的灵敏度，保证了结果的准确性；③本筛查中心采用的筛查召回标准为TSH在9 μIU/mL及以上，根据Ford 和LaFranchi［10］的研究结果，TSH 筛查值从20～25 μIU/mL 降低到6～10 μIU/mL 时，CH 发病率增加2.20 倍，因此TSH 筛查值降低可能使得CH 的诊断增加；④社会以及家长越来越重视新生儿筛查，从而使召回率提高，增加了确诊率。本文资料还显示，在浙江省的10 个地市中，山区衢州、丽水地区CH 发病率相对较高，而山区地理环境下人群碘的摄入量较其他沿海地区低，因此CH发病可能与人群碘缺乏也相关。

HPA 是由于PAH 或其辅酶四氢生物蝶呤缺乏致使机体内Phe 累积，引起以神经系统损害症状为主要特征的一组氨基酸代谢异常疾病。浙江省近24 年共确诊HPA 患儿563 例，其中cPKU 508 例，BH4D 55 例，绝大部分为cPKU，平均发病率为1/21 176，略低于以往报道的全国发病率1/11 628，高于湖南（1/45 454）、广西（1/83 333）、广东（1/50 000）等南方地区，该病在中国发病率呈现南低北高趋势［11］。另外，各国发病率存在差异，欧洲约为1/100 000，土耳其约为1/4000，日本约为1/78 400［12］，可能与基因多态性、种族及地域不同相关［13］。

既往研究在CH 患者中发现20 余种基因变异［14］，其中甲状腺发育不良与TSHR、FOXE1、PAX8、NKX2-1、NKX2-5和GLIS3基因变异相关，甲状腺素合成障碍与DUOX2、TPO、TG、SLC5A5、SLC26A4和IYD基因变异相关［15］。本文资料97 例CH患儿进行基因检测，共检出9种基因发生变异，分别为DUOX2、TG、TPO、TSHR、DUOXA2、DUOX1、GLIS3、IGSF1和PAX8，其中DUOX2基因变异检出率高达69.0%，提示DUOX2基因变异是本地区CH 患者中最常见的变异类型，与相关文献提示DUOX2是东亚人群中发现变异频率最高的基因结果一致［16-17］。DUOX2是甲状腺过氧化氢产生系统的主要成分，涉及甲状腺激素合成障碍的重要环节，大多数DUOX2致病性变异会导致甲状腺激素生成障碍，而甲状腺激素合成障碍也是中国人群CH 的主要原因。本文资料DUOX2检出44 种变异，以错义突变为主，其中c.3329G＞A（p.R1110Q）检出率最高为16.4%，其次为c.1588A＞T（p.K530X）、c.2654G＞A（p.R885Q）和c.4027C＞T（p.L1343F），与相关文献报道的我国人群DUOX2热点突变相符［18-19］。本文资料中，检出频率较高的还有TG基因变异（12.4%）和TPO基因变异（9.7%）。TG基因变异导致非活性甲状腺激素、碘化物储存减少及甲状腺素合成障碍，目前已发现200 余种TG基因变异，本文资料检出TG基因变异13 种，突变频率相对较高的变异为c.1348delT（p.S450Pfs*29）、c.3808C＞T（p.R1270C）。我国西北地区TG基因热点突变为c.3035C＞T（p.P1012L）［20］，本文资料无该变异位点，推测TG基因变异可能存在地域差异。TPO缺乏导致碘有机化缺陷引起严重的激素合成障碍，从而导致CH的发生。目前报道TPO基因变异170 余种，在高加索人种中TPO变异检测率为20%～46%，而在东亚人种中TPO变异检测率不到10%［21］。本文资料发现TPO基因变异11种，c.2268dupT（p.E757X）是TPO基因最常见的变异，占26.6%，与相关文献报道的东亚人群的TPO基因热点突变相符［22-23］。本文资料多例CH 患者存在双基因变异或多位点同时变异的形式，最常见的变异基因组合是DUOX2联合TG或TSHR，表明CH 属于多基因疾病，遗传背景复杂，环境因素如碘摄入、营养或其他表观遗传因素可能通过影响基因表达导致CH 发生，但各变异体以何种机制参与CH 的致病过程还需要进一步的功能实验来证实。

HPA 致病基因分别是PAH 和BH4 合成代谢中的相关基因。目前已报道PAH基因1000 余种变异，本文资料250例cPKU患者中检出81种PAH基因变异，变异种类以错义突变为主，少数为无义突变、剪接突变，84.0%变异位于外显子，与PAH基因数据库记录相似（PAHvdb，http：//www.biopku.org/home/pah.asp）。既往研究表明，PAH基因突变谱存在种族和地域差异，欧洲最常见的变异为c.1222C＞T（p.R408W），意大利南部最常见的变异为c.782G＞A（p.R261Q），而在西班牙人群中最常见的变异是c.194T＞C（p.I65T）。在中国人群中，台湾地区最常见的变异为c.721C＞T p.R241C（36.0%）；cPKU患者中最常见的变异为c728G＞A（p.R243Q）（17.5%）［24-27］。本文资料显示，PAH基因最常见变异为c728G＞A（p.R243Q）、c.721C＞T（p.R241C）、c.611A＞G（p.Y204C）、c.442-1G＞A、c.331C＞T（p.R111*）和c.1068C＞A（p.Y356*），分别占24.4%、15.0%、8.1%、5.6%、5.0%和4.4%。本文资料7种PAH基因新发变异分别为c.107C＞A（p.S36*）、c.137G＞T（p.G46V）、c.148A＞G（p.K50E）、c.285C＞T（p.I95I）、c.843-10delTTCC、exon4-7del 和c.1066-2A＞G，扩展了PAH基因谱。PTS是与四氢生物蝶呤合成代谢最常见的基因。中国人群PTS基因常见的变异位点有c.155A＞G（p.N52S）、c.259C＞T（p.P87S）、c.286G＞A（p.D96N）、c.272A＞G（p.K91R）、c.84-291A＞G/p.Y27Rfs*17、c.317C＞T（p.T1be06M）、c.166G＞A（p.V56M），其中中国南方患者常见的变异为c.155A＞G（p.N52S），北方患者常见的变异为c.286G＞A（p.D96N），c.259C＞T（p.P87S）和c.84-291A＞G 在南北方均可见［28-30］。本文资料以上常见变异均有检出，共检出PTS基因变异12种，其中热点突变位点为c.259C＞T（p.P87S），其次为c.84-291A＞G、c.155A＞G（p.N52S）。

综上所述，浙江省新生儿筛查开展20余年以来，共计筛查约1200 万新生儿，随着政府政策主导、各部门及全社会参与，筛查体系覆盖全省，筛查率逐年提高。浙江省CH 发病率呈增高趋势，与浙江省积极推进样本信息化物流质控项目、TSH检测方法不断改进提高了筛查准确性及灵敏度以及社会和家长越来越重视新生儿筛查相关。HPA 发病率与全国平均水平相当，略高于南方其他地区发病率。CH、HPA患儿基因检测呈现了浙江省CH 基因谱和PAH、PTS基因分布特点等信息，可为进一步完善新生儿筛查提供参考。

本文附表见电子版。