星孢寄生菇的分离鉴定筛选及其生理特性相关性

周会明　王志敏　古广红　孔雨非　李加豪　保龙倩　康晟菀　赵燕

摘 要 开展星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）的分离鉴定及其营养生理与个体发育相关性研究，以期为加快其他珍稀菇类的驯化进程奠定基础。从3株野生寄生菇属子实体中分离获得纯培养菌丝体，采用形态学与分子生物学鉴定其分类地位。以子实体湿质量与生物学效率为主要指标，筛选最优菌株及其基础培养基，并测定营养物的种类、增加倍数及其加入方式对最优菌株个体发育的影响。结果表明：两种鉴定方法结果一致，3株真菌均为星孢寄生菇。菌株YAASM4665在9种筛选培养基上的农艺性状优于其他菌株，最优基础培养基为小麦粉15 g、米饭35 g、水50 mL，pH自然。当基础培养基中的水增加至80 mL或用50 mL土豆汁代替，加入0.50%的葡萄糖，用等质量的黑豆粉代替小麦粉，营养物增加1/2倍以及营养物混合加入等单因素处理下，该菌株的农艺性状综合表现较好，其中土豆汁培养基子实体湿质量最大（4.86 g），黑豆粉培养基生物学效率最高（8.50%），基质中加入2%的葡萄糖时最有利于延迟厚垣孢子的形成。厚垣孢子形成期与其他农艺性状存在一定程度的相关性，菌丝萌发期与子实体湿质量是其主要影响因素。总之，星孢寄生菇个体发育受菌株遗传特性和营养因素的影响，厚垣孢子的形成不利于该菇子实体正常发育，菌丝萌发期对其综合影响最大，可为其他菇类的驯化提供参考。

关键词 星孢寄生菇；分离鉴定；菌株筛选；营养生理；个体发育

星孢寄生菇隶属于担子菌纲（Basidiomycota）、伞菌目（Agaricales）、离褶伞科（Lyophyllaceae）、寄生菇属（Asterophora）。该菇作为一种兼有寄生与腐生特性的大型真菌，比一般菇类更容易人工栽培出菇[1]，同时，其菌褶上除附着担孢子外，菌盖表面还存在独特的厚垣孢子[2-3]。營养生理是众多野生菇类得以驯化的基础，个体发育是菇类营养生理在形态建成各阶段的直接体现，独特的生活史又是菇类对个体发育过程中异常环境的最终表达。因此，星孢寄生菇独特的营养方式和生活史是探究菇类营养生理与个体发育机理的理想材料，在绝大多数野生菇类仍处于未开发状态且其生长环境正遭受日益破坏之际，该研究对加速其他野生菇类种质资源驯化栽培进程意义重大。

国内外对星孢寄生菇的研究较少，主要集中在出菇条件[4]、形态学[5-7]、种质资源[8-10]、亲缘关系[11-12]等方面，但针对其个体发育的研究却极少，据文献报道，该菇存在两大孢子体系且担孢子的形成受厚垣孢子迅速产生抑制[3]。rDNA内转录间隔区（ITS）是研究真菌属内种间及种群系统学的有效手段[13]。营养生理的探究可弄清菇类营养需求规律、生长发育特点及其与基质营养的关系，并为其人工栽培打下基础[14]。个体发育研究是菇类应用与推广的基础，已成为杏鲍菇[15]、猴头菇[16]、双孢蘑菇[17]等众多菇类的研究热点，但没有合适的研究材料已成为珍稀菇类的研究难点。目前，针对星孢寄生菇的营养生理与个体发育关系的研究鲜见报道。

本研究以星孢寄生菇野生子实体的采集、分离、鉴定为基础，基于生理特性试验筛选最优菌株及其基础培养基，探究菌株遗传特性与营养因素对最优菌株个体发育的影响，并弄清其厚垣孢子的形成与菇体农艺性状的关系，以期为其他珍稀食用菌的人工驯化提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

星孢寄生菇菌株YAASM4665、YAASM4666、YAASM4667由滇西科技师范学院食用菌科研小组采集，菌种保存于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所。

1.2 菌种的分离鉴定

采集现场测定星孢寄生菇子实体形态、大小及生长环境。挑选生长健壮、无病虫害的子实体带回实验室。在超净工作台内，先用75%酒精棉球将手擦拭消毒，再用镊子夹取酒精棉球对菇体表面消毒，然后在酒精灯外焰无菌区用手快速撕开菌柄，采用组织分离法，在菌柄和菌盖交界处用事先已灭菌的手术刀切取黄豆大小的菌肉组织迅速移入PDA（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂  1.5%，pH自然）培养基斜面，然后置于25 ℃培养箱遮光培养获得该菌的纯菌丝体。参照卯晓岚[18]主编的《中国大型真菌》对采集的新鲜子实体从形态特征与生长环境两个方面进行初步鉴定。接种少量星孢寄生菇菌丝至YPD（蛋白胨0.2%，酵母粉0.2%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5%，pH自然）液体培养基摇动恒温（25  ℃）培养10 d，采用CTAB法抽提DNA，使用0.8%琼脂糖检测DNA的质量和浓度。以ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG-3′）为引物，对已提取的DNA进行PCR扩增、产物测序以及系统发育树构建等[19]。

1.3 最优菌株及基础培养基筛选

根据星孢寄生菇具有与虫草属真菌蛹虫草（Cordyceps militaris）均能生长于活体的特性[20]，以小麦粉为对照，采用组培瓶培养法，设计9种不同处理的小麦粉与熟米饭培养基质（表1），配方1～5加水均为50 mL，配方6～9分别在配方2～5的基础上，减少水分的加入量，以配方6 的10 mL水为基础，每增加10 g小麦粉和降低10 g米饭加水15 mL）。

制作过程：选择新鲜、干燥、无病虫的大米与小麦粒，将经蒸锅蒸熟的颗粒状大米米饭先置于干净的340 mL组培瓶底，压实，再加入经粉碎机处理的小麦粉、铺平、加水，pH自然，然后清洁瓶口并覆盖一层中间留有面积为0.5 cm2大小的聚乙烯塑料膜，最后覆盖4层报纸并用棉细绳封口。采用高温间歇灭菌法，121 ℃下灭菌99 min，室温培养3 d后再次121 ℃下灭菌60 min，然后接经种子培养基活化的3个星孢寄生菇菌株，在25 ℃下遮光培养，记录菌丝萌发期（d）、生长势（菌丝浓密用“+++”表示，较浓密的用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生长用“－”表示）[21-22]，测定封口期（从接菌至菌丝长满培养基瓶口的时间）、原基分化期（d）（从接种到长出原基的时间）、幼菇形成期（d）（从接种到长出子实体的时间）、厚垣孢子形成期（d）（从接种到第一朵子实体上形成厚垣孢子的时间）、子实体湿质量（g）、菌盖直径（mm）、菌柄长度（mm）、菌柄直径（mm）等农艺性状，每个配方的生物学效率=（子实体鲜质量）/培养基干质量×100%。根据子实体湿质量（g）与生物学效率（%）筛选出最优菌株以及相应的基础培养基配方。下同。

1.4 最优菌株培养基优化及其农艺性状相关性研究

以最优菌株和基础培养基（配方1）为对照（表2），探究水分含量（配方1～3）、土豆成分（配方1、4、5）、葡萄糖含量（配方1、6、7、8）、豆科作物种类（配方1、9、10、11、12）、营养物增加倍数（配方1、13、14）、营养物加入方式（配方1、15、16）对最优菌株生长发育的影响，每处理3次重复，并采用相关性与通径分析探究厚垣孢子形成期与其他农艺性状之间的关系。制作过程同“1.3”，其中配方1～14米饭均置于玻璃瓶底，配方15小麦粉置于玻璃瓶底，米饭置于最上层，配方16小麦粉与米饭混匀加入；取450 g土豆，加入450 mL水，经榨汁机处理，采用200目土壤筛过滤并徒手挤压，土豆汁和土豆渣均在60 ℃下除水获取干物质。

1.5 统计分析

所得结果均为3次重复，数据为“平均值±标准差”。采用SPSS 19.0 统计软件Duncans法对所有数据进行分析[23]。

2 结果与分析

2.1 野生菌株鉴定结果

2021年7月30日，在云南省临沧市忙角社区树林的红菇属（Russula）真菌腐烂子实体上采集到3株野生幼嫩子实体，其子实体小，菌盖直径为0.55～3.30 cm，白色，幼菇近球形，成熟菇半球形且覆盖一层土黄色粉末状的厚垣孢子；菌肉和菌褶白色，后者直生、分叉、稀疏；菌柄白色、柱状、内实，其基部有白绒毛，长度1.10～6.20 cm，直径约为0.20～0.45 cm。从形态学初步鉴定3个菌株均为星孢寄生菇（图1）。

菌株YAASM4665、YAASM4666、YAASM4667测序获得的ITS序列长度分别为731 bp、669 bp、658 bp，与GenBank中的2个星孢寄生菇ITS序列（登录号KP192566.1、MZ159455.1）相似性最高。结合其形态学特征，鉴定菌株3个菌株均为星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）（图2）。

2.2 最优菌株及基础培养基筛选结果

由表3可知，菌株YAASM4665的菌丝萌发期均为3 d。配方2～5上，基质总质量不变下，仅改变小麦粉与米饭的比例，该菇农艺性状大部分参数均高于对照组，随着小麦粉的增加，菌丝封口期延长，菌盖直径增加，原基分化期与厚垣孢子形成期却减小。配方6～9上，该菇封口期、幼菇形成期、厚垣孢子形成期随着小麦粉与水分的增加而延长，其子实体湿质量与生物学效率均低于配方3。总之，配方2上厚垣孢子形成期最长  （15 d），但子实体湿质量最小（0.25 g），配方3上子实体湿质量最大（4.80 g）且在显著性因子0.05和0.01上与其他配方相比均达到极显著水平，厚垣孢子形成期时间仅低于配方2，生物学效率最高（9.60%）。

菌株YAASM4666的菌丝萌发期除在配方9上最长（5 d）外均为3 d，对照组封口期最小（8 d）且未形成幼菇。配方2～5上，小麦粉的增加有利于菌丝封口期的延长。配方6～9上，随着小麦粉与水分的增加，封口期延长，其子实体湿质量与生物学效率均低于配方3。总之，配方2上厚垣孢子形成期最长（17 d），配方3上子实体湿质量最大  （2.12 g），在显著性因子0.05和0.01上与配方2、7不显著，但与其他配方相比均达到极显著水平，其厚垣孢子形成期（16 d）仅低于配方2，生物学效率最高（4.24%）。

菌株YAASM4667的菌丝萌发期也均为  3 d，对照组封口期最短（8 d），原基分化期最长（15 d）且未形成幼菇。配方2～5上，小麦粉的增加有利于菌丝封口期、原基分化期延长。配方  6～9上，随着小麦粉与水分的增加，封口期延长，其子实体湿质量与生物学效率均低于配方3。总之，配方5上子实体湿质量（1.17 g）与生物学效率（2.34%）最大，但配方3上厚垣孢子形成期最长（15 d），上述筛选指标仅次于配方5，且子实体湿质量（1.16 g）在显著性因子0.05和0.01上与配方4、5不显著，但与其他配方相比均达到极显著水平。

综合考虑，3株菌株子实体湿质量与生物学效率分别在配方3、配方3、配方5上达到最高，其中菌株YAASM4665上述筛选指标均高于其他菌株。因此，该菇最优菌株为YAASM4665，配方3为最优基础培养基质。

2.3 最优菌株YAASM4665培养基优化结果

由表4可知，营养物的种类、增加倍数及加入方式对该菇生长发育的影响较大。营养阶段，豌豆粉基质上菌丝萌发期最短（1 d），生长势在大部分配方上浓密，封口期在红豆粉基质上最短  （5 d）。生殖阶段，红豆粉基质上原基分化期  （6 d）与幼菇形成期（8.33 d）最短，基质加入2%  （1 g）葡萄糖时厚垣孢子产生时间最长（30 d），基质水被同体积的土豆汁替代后子实体湿质量最大（4.86 g），且显著性因子0.05和0.01上与其他配方相比达到极显著水平，菌盖与菌柄特征因基质不同而差异较大，黑豆粉基质上生物学效率最高  （8.50%）。

与对照相比，基质含水量与菌株幼菇形成期、子实体湿质量、菌柄长度、生物学效率同步增加，当水分为80 mL（配方3）时，其菌丝萌发期与厚垣孢子形成期缩短，大部分农艺性状明显增加，其中子实体湿质量与生物学效率分别为3.95 g、  7.90%。基质水被同体积的土豆汁（干质量：  34.33 g）（配方4）替代后，该菇子实体参数均明显增加，尤其是子实体湿质量达到最大，但大部分农艺性状均缩短，生物学效率降低（5.76%）。土豆渣（干质量：44.08 g）（配方5）替代对照组基质后菌丝生长势减弱，大多农艺性状表现较差，其中厚垣孢子形成的时间缩短，子实体湿质量仅1.36 g。葡萄糖含量增加，菌丝生长势逐渐减弱，基质中加入0.5%（0.25 g）（配方6）葡萄糖时，与对照相比其封口期、原基分化期、幼菇形成期、厚垣孢子形成期（15.5 d）均缩短，但子实体相关参数均明显增加，子实体湿质量达3.36 g；当加入2%  （1 g）（配方8）葡萄糖时封口期、原基分化期、幼菇形成期延长，菌盖直径与生物学效率减小，子实体湿质量仅1.88 g，但厚垣孢子形成期最长，菌柄参数增加。豆类基质上与对照相比其菌盖直径减小，厚垣孢子形成期缩短，其中豌豆粉（配方9）、绿豆粉（配方11）、红豆粉（配方12）替代小麦粉后大部分生长发育时间缩短，子实体湿质量与生物学效率降低，被黑豆粉（配方10）替代后，封口期、原基分化期、幼菇形成期延长，厚垣孢子形成期缩短，菌盖直径与菌柄长度降低，但子实体湿质量（4.25 g）与生物學效率增加且在豆类中最大。营养物倍数的增加与对照相比，该菇子实体湿质量、菌盖直径、菌柄长度、菌柄直径均有所增加，生物学效率降低，其余参数变化不大，其中营养物增加1/2倍（配方13）时其农艺性状表现较好，子实体湿质量达到（3.91 g）。改变营养物的加入方式后，与对照相比菌丝萌发期与厚垣孢子形成期缩短，原基分化期延长，菌盖直径减小，其中营养物质混匀加入（配方16）时，其子实体湿质量（3.90 g）与生物学效率明显增加，该处理综合表现最佳，而营养物质非混匀加入时上大多农艺性状表现较差。

2.4 厚垣孢子形成期與其他农艺性状相关性  分析

由表5可知，菌株YAASM4665的厚垣孢子形成期与原基分化期、幼菇形成期、菌柄直径呈不显著正相关，与菌丝萌发期、菌丝封口期呈显著正相关（P<0.05），与菌盖直径、菌柄长度、生物学效率、子实体湿质量呈负相关，其他农艺性状之间均存在一定程度的相关性。

上述相关性分析只能显示厚垣孢子形成期与各农艺性状之间的直接关系，还要考虑不同农艺性状之间相互作用对其影响，需要通过逐步回归分析法把厚垣孢子形成期与其他农艺性状之间的相关性分解为直接作用与间接作用，以明确不同农艺性状的相互作用对厚垣孢子形成期的影响。

以厚垣孢子形成期为因变量Y，菌丝萌发期、菌丝封口期、原基分化期、幼菇形成期、菌盖直径、菌柄长度、菌柄直径、子实体湿质量、生物学效率分别为自变量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9，剔除偏回归系数不显著的自变量，建立Y=6.719+4.564X1-2.280X8的最优多元回归方程，X1与X8在回归方程中统计量值F分别是6.110、6.674，P值分别是0.027、0.010，因此，根据多元线形回归方程的整体检验可知方程是极其显著的。同时，经过对该方程常数项与自变量进行检验，常数项对应的置信水平为0.145，该值远比0.05大，说明常数项对方程显著，自变量X1、X8的置信水平分别为0.004、0.038，该值远比常用的置信水平0.05要小且不等于0，因此，该方程自变量的系数也是显著的。总之，方程的整体、常数项以及自变量检验均显著，需要进一步做通径分析（表6）。

通径分析表明：多元线形回归方程中直接通径作用的关联程度为X1>X8，间接通径的关联程度与其相反（X8>X1），决策系数的大小为  X1>X8，说明X8通过X1对Y的间接作用大于X1通过X8对Y的间接作用（0.261>-0.174），即子实体湿质量对厚垣孢子形成期的间接影响大于菌丝萌发期，但菌丝萌发期对厚垣孢子形成期的综合作用最大（R2=0.273）。

3 讨  论

星孢寄生菇作为寄生菇属具有寄生[2]和腐生的独特大型真菌，其生活史中担孢子与厚垣孢子两大孢子体系[3]及其营养方式成为当前研究重点，尤其厚垣孢子的形成机理与子实体形成极快成为众多野生菇类驯化栽培的突破口，因此，探究该菇个体发育与基质营养的关系对上述研究有重要意义。

本研究表明，最优菌株YAASM4665子实体湿质量与生物学效率在基础培养基（小麦粉15 g、米饭35 g、水50 mL，pH自然）上均高于其他菌株，各菌株适宜生长培养基的加水量与小麦粉和米饭组合有关，说明星孢寄生菇菌株间营养生理差异较大，其生长发育在小麦粉与米饭的培养基组合上优于单一的小麦粉，菇类农艺形状与菌株遗传相关[24]。同时，基础培养基中水增加至80 mL或被土豆汁代替，添加0.5%的葡萄糖，增加1/2倍的营养物，小麦粉被黑豆粉代替，营养物混合加入单因素处理下，最优菌株农艺性状综合表现较好，说明该菇的个体发育除受品种[25]影响外，还受营养物的种类、增加倍数及加入方式影响较大。因此，适宜的基质含水量与营养种类[26]、合理的营养物配比[27]、均衡的营养供给[28]等有利于提高菇类的产量。最后，厚垣孢子形成期与子实体湿质量、菌盖直径、菌柄长度等呈负相关，说明厚垣孢子是该菇生长发育的一个重要特征，不利于子实体的正常发育。

上述结论验证了该菇具有腐生的营养特性且易出菇，营养物的种类、数量、加入方式对其个体发育影响较大，厚垣孢子的形成与农艺形状相关，有望为其他珍稀食用菌的人工驯化提供理论指导，但营养物（如大米和小麦）的组分、地域、时间来源、用量、培养容器以及操作人员技术水平、试验设备型号等因素均可能引起试验误差。

总之，星孢寄生菇作为理想的个体发育研究材料，其生长发育与遗传和营养条件息息相关，不同因素下其厚垣孢子的产生存在一定程度的差异，有必要针对其开展环境胁迫[29]、胞外酶活性[30]、菇体转录组与蛋白组分析[31- 32]等方面进行系统的研究。同时，该菇快速出菇的原因、寄生与腐生的营养方式之间的关系以及营养物对个体发育的作用机理也有待进一步深入研究。

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Isolation，Identification，Screening and Correlation of Physiological Characteristics of Asterophora lycoperdoides

ZHOU Huiming，WANG Zhimin，GU Guanghong，KONG Yufei，LI Jiahao，BAO Longqian，KANG Shengwan and ZHAO Yan

Abstract The isolation and identification of Asterophora lycoperdoides and the correlation between their nutritional physiology and ontogeny were invesitigated to provide a theoretical basis for expediting the domestication process of other rare mushrooms. In this paper，three pure cultured mycelia strains were isolated from the fruiting bodies of three wild Asterophora.Their taxonomic statuses were identified by morphology and molecular biology. The wet mass and biological efficiency of the fruiting bodies were used as the main indicators to screen and identify the optimal strains and their corresponding basic media. The effects of different nutrient types，increase multiples and addition methods of nutrients on the ontogeny of the optimal strain were determined..The two identification approaches consistently categorized the three wild fungi strains within the A.lycoperdoides species.Among the screened media，strain YAASM4665 exhibited superior agronomic traits on nine media compositions，with the optimal basic media consisting of 15 g of wheat flour，35 g of cooked rice，and 50 mL of water，maintaining a natural pH value.A comprehensive investigation of five factors，including increasing the water content in basic media to 80 mL or substituting it with 50 mL of potato juice，adding 0.50% glucose，replacing wheat flour with an equal mass of black bean flour，increasing nutrient levels by 1/2 multiples，and nutrient mixture，resulted in the optimal strain outperforming all other selected media.The highest fruiting body wet mass  was achieved using potato juice （4.86 g），while the black bean flour media exhibited the highest biological efficiency （8.50%）.The addition of 2% glucose facilitated chlamydospore formation delay. The chlamydospore formation period was found to be correlated with other agronomic traits to some extent，The mycelia germination period and fruiting body wet mass were identified as the main influencing factors. In conclusion，the ontogeny of A.lycoperdoides is affected by the genetic traits of the strainand nutrient factors，the chlamydospore formation is unfavorable to normal development of the fruiting bodies. The mycelium germination period may exerts the most significantly comprehensive impact on the chlamydospore formation. The findings above can be of any reference for domestication of other mushrooms.

Key words Asterophora lycoperdoides; Isolation and identification;Strain screening;  Nutritional physiology; Ontogeny

Received2022-10-28Returned 2023-01-06

Foundation item Joint Specialized Project of Local Universities in Yunnan Province[No. 2019FH001（-059）].

First author ZHOU Huiming，male，associate professor. Research area：domestication，genetics and cultivation of edible fungi. E-mail：632243530@qq.com

Corresponding   author GU Guanghong，male，teaching assistant. Research area：domestication and genetics of macrofungi germplasm resources. E-mail：1786288023@qq.com

（責任编辑：史亚歌 Responsible editor：SHI Yage）

收稿日期：2022-10-28修回日期：2023-01-06

基金项目：云南省地方本科高校（部分）基础研究联合专项[2019FH001（-059）]。

第一作者：周会明，男，副教授，主要从事食用菌驯化、遗传及栽培研究。E-mail：632243530@qq.com

通信作者：古广红，男，助教，从事大型真菌种质资源的驯化与遗传研究。E-mail：1786288023@qq.com