粪菌移植对小鼠抑郁样行为及海马内源性大麻素相关分子表达的影响

马欣旭，薛姗姗，张 甜，陈怡环，蔡 敏 (空军军医大学西京医院心身科，陕西 西安 710032)

抑郁症以显著而持久的情绪低落为主要特征，同时伴有睡眠质量差、食欲减退、反应迟钝、注意力不集中和兴趣缺失等症状[1]。据世界卫生组织数据显示，全球目前约有3.5亿人患有抑郁症[2]，目前抑郁症多采用药物治疗、心理治疗和物理治疗等方案，但其疗效不尽如人意[3]，因此进一步探究抑郁症患者的发病机制具有重要的科学意义。

肠道菌群可通过肠-脑轴调节脑功能，在情绪加工和行为决策中起关键作用[4-6]。近年来的大量研究证实，抑郁症患者菌群失调，且放线菌门、拟杆菌、肠杆菌科、肠杆菌属的增加及毛螺菌门、普拉梭菌的降低与抑郁症状相关[7]，抗生素、益生菌治疗能有效缓解，这提示肠道菌群紊乱也是抑郁症的发病机制之一，但肠道菌群失调导致抑郁的具体分子机制并不清楚。

海马内源性大麻素(endocannabinoid，eCB)系统在抑郁症病理生理机制中的作用受到广泛关注，海马eCB信号的异常与抑郁样行为有关[8]。已有研究发现，“伪无菌”小鼠接种抑郁小鼠肠道菌群后，表现出明显的抑郁样行为，其海马神经发生减少，脑内2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)水平显著下降[9]。然而，移植抑郁症患者肠道菌群对小鼠海马eCB系统的作用及其与抑郁样行为之间的相关性尚未见报道，因此本研究以“伪无菌”小鼠为研究对象，分别接种抑郁症患者和健康个体肠道菌群，观察小鼠抑郁样行为并探讨对海马eCBⅠ型受体(cannabinoid type 1 receptor，CB1R)二酰基甘油脂肪酶α(diacylglycerol lipase α，DAGLα)和N-酰基磷脂酰乙醇胺磷脂酶D(N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D，NAPE-PLD)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性C57BL/6J小鼠购于空军军医大学实验动物中心。饲养环境：昼夜各半循环照明(即保持12 h昼夜交替)，饲养温度(22±2)℃，湿度保持在(55±5)%。饲养环境安静且干净整洁，饲养期各组小鼠可自由获得食物和水。本实验经空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准(许可证号：KY20193307-2)，实验过程遵循神经科学和行为学实验中关于哺乳动物的饲养和使用规定。

1.1.2 主要试剂 无菌PBS(AG29791799，cytiva，美国)；甘油(C3H803，信泰生物，中国)；氨苄西林(NO907A，meilunbio，中国)；庆大霉素(00420A，meilunbio，中国)；甲硝唑(01224A，meilunbio，中国)；新霉素(S0912A，meilunbio，中国)；万古霉素(J0628B，meilunbio，中国)；液体硫乙醇酸盐培养基(HB5190，海博生物，中国)；琼脂(EZ6688B172，BioFroxx，德国)；RIPA强裂解液(BA0615，中晖赫彩，中国)；BCA定量试剂盒(WB319621，Thermo Scientific，美国)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(PE012，中晖赫彩，中国)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(CW0022，康为世纪，中国)；anti-CB1R(ab259323，1∶500，Abcam，英国)；anti-DAGLα(#13626，1∶250，Cell Signaling，美国)；anti-MAGL(100035，1∶200，Abcam，英国)；anti-NAPE-PLD(ER 191-52，1∶200，华安生物，中国)；anti-FAAH(101600，1∶200，Cayman，美国)；anti-β-actin antibodies(ab8227，1∶5 000，Abcam，英国)。

1.1.3 主要仪器 行为录像系统(一唯科技，中国)；Top Scan行为分析系统(TopScan3D，Clever Sys，美国)；冷冻高速离心机(75002420，Thermo Scientific，美国)；冷冻型高通量组织研磨器(SCIENTZ-48L，Scientz，中国)；酶标仪(A51119500C，Thermo Scientific，美国)；电泳仪(00001，Bio-Rad，美国)；转膜仪(1704150，Bio-Rad，美国)；凝胶成像分析系统(1708265，Bio-Rad，美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验设计 小鼠适应性饲养1周后，建立“伪无菌”小鼠模型，随后将“伪无菌”小鼠随机分为对照组和抑郁组，其中，对照组6只，接种健康个体肠道菌群3周；抑郁组10只，接种抑郁症患者肠道菌群3周。在粪菌移植结束后进行行为学测试(包括糖水偏好实验、旷场实验和悬尾实验)。

1.2.2 “伪无菌”模型构建 参考赵慧亮等[10]报道的方法，将氨苄西林、庆大霉素、甲硝唑、新霉素(均为0.250 mg/d)和万古霉素(0.125 mg/d)制备成抗生素“鸡尾酒”，通过灌胃的方式使用抗生素“鸡尾酒”连续灌胃14 d以广泛清除小鼠的肠道菌群。最后一次抗生素灌胃结束48 h后，开始进行粪菌移植重建肠道微生物群[11]。

1.2.3 菌液制备及粪菌移植

1.2.3.1 抑郁症患者粪便采集 选择空军军医大学西京医院2021年5月至7月心身科门诊抑郁症患者6人，平均年龄(48.33±2.88)岁，平均病程(1.79±1.76)年，汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale，HAMD)评分(24.3±4.5)分。本研究方案通过空军军医大学西京医院医学伦理委员会审批(许可证号：KY20193307-2)。入组前已将本研究可能存在的风险和受益，具体研究计划告知患者和家属。所有患者表示理解并签署纸质版知情同意书后收取其粪便样本。

抑郁症患者纳入标准：18～65岁；符合《美国精神障碍诊断与统计手册第五版》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fifth Edition，DSM-5)抑郁障碍的诊断标准；HAMD-17评分≥18分；入组前未使用过抗精神病药物、抗抑郁药及镇静催眠类药物，且未接受过心理治疗和物理治疗；最近1个月内未使用益生元、益生菌和益生菌发酵食物；未使用任何抗生素。排除标准：患有其他符合DSM-5诊断标准的精神障碍；患有炎性肠病、克罗恩病、胰腺炎、脂肪肝等消化系统疾病者及患有其他器质性疾病者；肥胖，体质量指数≥28.0 kg/m2；高血糖，空腹血糖≥6.1 mmol/L和/或2 h内血清总胆固醇≥7.8 mmol/L和/或确诊为糖尿病后已进行治疗者；甘油三酯≥2.3 mmol/L；高血压，收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg；饮食严重不均衡者，如高脂肪饮食偏好者或长期素食者；有酒精或其他物质依赖或滥用者；妊娠期或哺乳期抑郁症患者[12-13]。

健康个体纳入标准：18～65岁；既往未曾患过任何精神障碍疾病，HAMD-17评分<8分。排除标准：患有其他精神疾病和其他躯体疾病，尤其是胃肠道疾病；有严重自杀倾向者；有酒精或其他物质依赖或滥用者；妊娠期或哺乳期女性抑郁症患者；最近1个月内接受过抗生素或益生菌治疗[12-13]。

1.2.3.2 菌液制备 使用粪便取样器采集抑郁症患者和健康个体粪便2～3管，称取1 g粪便，加入5 mL无菌PBS吹打混匀，用纱布制成0.25 mm孔径的筛子，过滤除去杂质，收集滤液；将滤液分装至2 mL管中，6 000g，4 ℃离心15 min，弃上清；加入1 mL无菌PBS重悬沉淀，将菌液稀释至106、107、108、109、1010cfu/mL。将各浓度菌液吸取100 μL进行平板涂布，放入37 ℃培养箱中培养，20 h后取出并用平板计数法计算菌落数，用无菌PBS将菌群终浓度稀释为2.5×1010cfu/mL，-20 ℃保存备用。

1.2.3.3 粪菌移植 待“伪无菌”小鼠模型建立成功后，将小鼠随机分为对照组和抑郁组两组，分别灌胃抑郁症患者及对照组的肠道菌群混悬液(10 μL/g)，每周一、三、五灌胃，持续3周以重建肠道微生物群[11]。

1.2.4 行为学实验 行为学测试在最后一次粪菌移植24 h后进行。每次实验前，需将小鼠置于实验环境中至少适应30 min。

1.2.4.1 糖水偏好实验 将各组小鼠进行单笼饲养，给予两瓶20 g/L蔗糖适应24 h，然后用饮用水代替其中一瓶20 g/L蔗糖，适应24 h，时间中点(即12 h后)交换蔗糖和饮用水水瓶的位置。适应性训练结束后剥夺小鼠食物和水24 h。在测试阶段，预先称重饮用水和20 g/L蔗糖溶液，小鼠自由饮用液体2 h(自由饮用1 h后交换两个水瓶的位置)。测量蔗糖和饮用水的消耗量，计算蔗糖偏好率。蔗糖偏好率=[蔗糖消耗量/(蔗糖消耗量+饮用水消耗量)]×100%。

1.2.4.2 旷场实验 用750 mL/L乙醇将旷场擦拭干净后，将小鼠置于旷场行为观察箱(50 cm×50 cm×40 cm)中，10 s适应期后通过位于旷场正上方的摄像机记录小鼠行为10 min，采用Top Scan行为学分析系统(Top Scan，Clever Sys Inc，美国)分析小鼠进入旷场及旷场中心区的次数、中心区停留时间、中心运动距离、运动总距离、中心区时间比、中心运动距离比等。

1.2.4.3 悬尾实验 将动物尾部悬吊，胶布粘在离小鼠尾端2 cm处，使小鼠呈倒悬体位，头部离悬尾箱底部20 cm；摄像机记录小鼠行为6 min，采用Top Scan行为学分析系统分析后5 min小鼠的不动持续行为。

1.2.5 Western blotting 行为学实验结束后处死小鼠，迅速剥离海马组织，并加入组织裂解液，经匀浆和离心后，制备蛋白样品。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离并转移到PVDF膜上(每通道总蛋白40 μg)，50 g/L脱脂奶粉室温摇床封闭，后加入特异性一抗进行过夜孵育(4 ℃)。漂洗后加入相应二抗，最后使用凝胶成像分析系统(Bio-Rad，美国)检测相关分子。使用图像分析系统测定各蛋白的相对含量。

2 结果

2.1 粪菌移植对小鼠抑郁样行为的影响

行为学结果显示，与对照组比较，抑郁组进入中心区次数、中心区运动距离、运动总距离、中心区停留时间比、蔗糖摄入量均显著减少，悬尾不动时间显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)，表明抑郁症患者肠道菌群可使小鼠产生抑郁样行为。

2.2 各处理组海马eCB相关分子表达的比较

Western blotting结果显示，与对照组比较，抑郁组小鼠海马组织中CB1R、eCB N-花生四烯酸氨基乙醇(anandamide，AEA)和2-AG的合成酶DAGLα、NAPE-PLD表达水平均明显下调，差异有统计学意义(P<0.05，图1)，表明抑郁症患者肠道菌群可显著改变小鼠海马组织中大麻素相关分子的表达。

CB1R：海马eCBⅠ型受体；DAGLα：二酰基甘油脂肪酶α；NAPE-PLD：N-酰基磷酯酰乙醇胺磷脂酶D。aP<0.05，bP<0.01。图1 两组小鼠海马CB1R、DAGLα、NAPE-PLD蛋白表达情况

2.3 海马eCB分子表达量与抑郁样行为的相关性分析

对各组海马eCB相关分子表达量和行为学指标进行相关分析后发现，海马DAGLα蛋白表达量与进入旷场中心区次数、中心区运动距离和糖水偏好率均呈正相关，与悬尾不动时间则呈负相关，且有显著性差异(P<0.05)；海马NAPE-PLD蛋白表达量与进入旷场中心区次数、中心区运动距离、中心区停留时间比和糖水偏好率均呈正相关，与悬尾不动时间则呈负相关，有统计学差异(P<0.05，表2)。上述结果提示，小鼠海马中的eCB相关蛋白表达量与抑郁样行为密切相关，可能在抑郁症患者肠道菌群所致抑郁过程中起着重要作用。

表2 海马eCB相关分子与小鼠行为学指标的Pearson相关分析

3 讨论

肠道菌群是人体最大的细菌储存库，总数高达1014，也被称为“第二大脑”。近年来，大量研究证实肠道菌群可通过微生物-肠-脑轴调节情绪和行为，在抑郁症发病机制中扮演重要角色。粪菌移植可将供体肠道菌群移植到受体肠道内并使其长期稳定生长。动物研究表明，“伪无菌”小鼠接种抑郁小鼠肠道菌群后表现出明显抑郁样行为[14-16]，外源性补充益生元或益生菌可调节情绪，减少抑郁焦虑样行为[17-19]。然而，实验动物的生理代谢及肠道菌群构成与人的肠道菌群组成和代谢有明显差异。人源化菌群小鼠可有效控制宿主遗传背景、环境因素和菌群等，还可提供丰富的生物学信息，缩小动物与人的肠道菌群差异，有效避免人体实验伦理问题。因此，采用人源化菌群小鼠探讨人肠道菌群与人类疾病的关系是目前研究肠道菌群的重要手段之一[20]。研究表明，“伪无菌”大鼠和无菌小鼠接种抑郁症患者肠道菌群后均表现出明显的抑郁样行为，且与肠道微生物的丰度和多样性的降低有关[21-22]；乳酸杆菌和双歧杆菌治疗可改善其抑郁样行为[23-24]。与上述研究结果相一致，本研究构建了“伪无菌”小鼠，发现较接种健康个体肠道菌群的小鼠，接种抑郁症患者肠道菌群的小鼠出现明显的抑郁样行为，表现为：进入旷场中心区次数减少、旷场中心区运动距离下降、旷场中心区停留时间比降低、糖水偏好减少、悬尾不动时间增加。上述发现提示本研究构建的“人源化”抑郁小鼠模型具有明显的抑郁表型，可用于后续指标的观察。

eCB系统作为一种逆行脂质信号系统，参与多种神经系统生理功能。近年来，eCB系统在抑郁症发展过程中的作用已被证实[25]。eCB系统包括eCB及其受体两部分，eCB主要有AEA和2-AG两种，分别由NAPE-PLD和DAGLα合成；eCB受体主要包括CB1R和CB2R，CB1R主要分布于海马、杏仁核、边缘系统以及额叶皮层等与抑郁密切相关的脑区。基础研究发现，慢性不可预见温和应激模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS)大鼠海马的CB1R和DAGLα的mRNA和蛋白水平下调，而氟西汀或电针干预可逆转该变化[26-27]。也有研究发现，CUMS大鼠海马内CB1R、DAGLα和NAPE-PLD蛋白表达下调，重复经颅磁刺激治疗后可逆转该变化[9]。本研究发现，“人源化”抑郁小鼠海马的CB1R和eCB合成酶DAGLα和NAPE-PLD表达下调，提示抑郁症患者粪菌移植可能降低了海马AEA和2-AG合成，从而抑制eCB系统活性。这一结果与CHEVALIER等[9]的研究相一致，提示抑郁症患者粪菌移植和抑郁小鼠粪菌移植存在相似的机制，而eCB则可能是其作用的关键机制之一。

我们进一步对行为学与海马eCB表达进行了相关性分析。发现海马DAGLα蛋白表达量与进入旷场中心区次数、中心区运动距离和糖水偏好率呈正相关，与悬尾不动时间则呈负相关；而海马NAPE-PLD蛋白表达量与进入旷场中心区次数、旷场中心区运动距离、旷场中心区停留时间比、糖水偏好率均呈正相关，与悬尾不动时间呈负相关，说明DAGLα和NAPE-PLD均与抑郁样行为相关，而且NAPE-PLD的关联性更为显著。已有研究证实，抑郁小鼠海马组织内AEA和2-AG含量下降，且抑郁小鼠肠道菌群亦可导致其海马组织内AEA和2-AG含量下降[9]。有研究表明，慢性应激大鼠海马内2-AG含量降低，给予CB1R拮抗剂AM251抑郁样行为得到缓解，海马内2-AG含量上升，且药物上调AEA和2-AG可缓解小鼠抑郁样行为[28]。此外，2-AG在应激反应和负反馈中起重要作用，JZL184阻断2-AG水解可产生抗抑郁作用，并增强抑郁小鼠的海马神经发生和突触可塑性。AEA作为另一种内源性配体，也参与了海马突触可塑性[27]。上述研究提示，DAGLα和NAPE-PLD表达降低，可能与抑郁症患者粪菌移植导致抑郁样行为密切相关。

此外，AEA由ω-6多不饱和脂肪酸(N6-polyunsaturated fatty acids，N6-PUFA)衍生物花生四烯酸(arachidonic acid，AA)衍生而来，N6-PUFA可促成AEA合成。通过饮食补充ω-3多不饱和脂肪酸(N3-polyunsaturated fatty acids，N3-PUFA)可上调AA[29]，长期缺乏N3-PUFA可致小鼠出现焦虑抑郁样行为，其eCB信号通路受损；2-AG可由十六烷酸通过甘油二酯转化而来，外源性补充脂肪酸可以上调eCB水平[30]；此外，无菌小鼠接种CUMS小鼠的肠道菌群后，其海马eCB水平减少，而外源性给予eCB前体AA或乳酸菌补充物则上调了该模型小鼠海马eCB水平[30]，对脂肪酸代谢的调节则是肠道菌群重要的生理功能之一，提示肠道菌群可能通过影响脂肪酸代谢进而调节海马eCB表达，从而影响小鼠抑郁样行为，但尚需进一步的实验证实。

综上所述，本研究发现抑郁症患者肠道菌群移植可诱导小鼠产生抑郁样行为，显著降低小鼠海马CB1R、DAGLα和NAPE-PLD表达，且小鼠抑郁样行为的产生与海马eCB相关分子表达下降有关。我们前期研究发现抑郁症患者肠道菌群构成和功能发生变化，且其甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸等相对丰度降低[12]，肠道菌群可通过调节细菌代谢物如脂肪酸等调节海马eCB系统，说明抑郁症患者肠道菌群可能通过调节海马eCB系统影响其临床症状。但本研究仍具有一定的局限性，只探讨了抑郁症患者和健康个体肠道菌群对小鼠海马组织CB1R、DAGLα和NAPE-PLD的影响，并未利用药物或者基因手段阻断eCB信号，验证其在粪菌移植中对抑郁症的影响。因此，海马eCB系统在人源化粪菌移植实验动物模型中的作用机制有待进一步研究。