骨癌痛及其动物模型研究进展

黄金路,郭澄

上海交通大学附属第六人民医院 药剂科，上海 200233

临床上，乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、 肺癌、胃肠道癌等均可不同程度地发生骨转移[1]，已发现癌转移到骨的部位有脊椎、肋骨、骨盆、长骨。据报道，乳腺癌和前列腺癌晚期患者骨转移的发生率高达90%[2]，且在我国呈上升趋势；肺癌、甲状腺癌和肾癌患者骨转移的发生率高达40%[3]，其中女性甲状腺癌的发病率增幅较快[4]。显而易见，受骨癌痛影响的患者众多。目前，临床治疗骨癌痛的药物主要有非甾体抗炎药（塞来昔布、吲哚美辛、对乙酰氨基酚等）、阿片类药物（吗啡、羟考酮等）、非阿片类中枢性镇痛药（曲马多）及一些辅助药物，如阿米替林、加巴喷丁、普瑞巴林。这些镇痛药物易诱发诸多不良反应，如成瘾、耐受、便秘、呼吸抑制、皮肤瘙痒、骨量丢失诱发骨折、胃肠道不良反应等。2019年12月，美国FDA发出警告，用于治疗神经损伤引起的疼痛、纤维肌痛的加巴喷丁和普瑞巴林可能会引起严重的呼吸困难。因此，现有治疗骨癌痛的镇痛药物在安全和疗效方面的不足致使骨癌痛患者服用该类药物的依从性大幅下降，继而使疼痛得不到有效控制，形成恶性循环。

另一方面，迄今对骨癌痛的发生和发展机制尚未完全阐明，这也极大地阻碍了骨癌痛的有效治疗。为此，众多国内外学者坚持不懈地探索着。在过去的30多年里，骨癌痛的治疗尽管有了较大进展，但效果不尽人意。患者的痛苦催促学者们开发了不同类型的骨癌痛模型，对骨癌痛进行持续不断的深入研究，以期探明骨癌痛的发病机制，发现新型镇痛药物靶点及作用机制。

1985年意大利学者首次报道了硬膜外给予丁丙诺啡和吗啡对骨癌痛的治疗[5]，而骨癌痛模型的首次建立则是在15年后，Mantyh团队利用NCTC2472小鼠骨肉瘤细胞制备了小鼠骨癌痛模型[6]。自此，骨癌痛动物模型已有近10种，取得了诸多进展。在此，我们简要综述骨癌痛动物模型的进展及相关研究。

1 骨肉瘤细胞诱导的骨癌痛模型及相关研究进展

1999年，Mantyh等利用NCTC2472小鼠骨肉瘤细胞首次建立了小鼠骨癌痛模型，此模型是将悬浮于20 μL含1%BSA的αMEM培养液的105个NCTC2472细胞自C3H/HeJ正常小鼠（体质量20～25 g）股骨的远端注射入骨髓腔，注射21 d后发生明显的骨损坏和疼痛行为反应，证明在手术侧脊髓神经胶质细胞大量肥大增生，而且发生强啡肽和c-Fos表达增强、P物质受体内化等神经化学和细胞重塑变化[6]；不久，他们又利用该骨肉瘤小鼠骨癌痛模型证明了炎性疼痛、神经源性疼痛及骨癌痛的神经化学变化的异同，提出骨癌痛是一种独特的疼痛[7-8]。

进入21世纪后，该团队在Nature Medicine和Cancer Research报道，在骨肉瘤小鼠骨癌痛模型上护骨蛋白（osteoprotegerin）能够显著阻断骨癌痛和脊髓神经化学重塑，并改善手术侧股骨的骨密度[9-10]。在这些研究基础上，Mantyh团队在使用该小鼠骨癌痛模型对骨癌痛发病的驱动机制的研究方面又不断有新的进展。比如Ghilardi等报道辣椒素受体TRPV1（transient receptor potential vanilloid subtype 1）在支配小鼠股骨的神经元细胞中高表达，给予TRPV1选择性拮抗剂JNJ-17203212（皮下注射）、ABT-102（口服）或干扰TRPV1基因表达可明显减轻持续性和运动诱发的伤害性疼痛行为，口服给予Trk选择性高效抑制剂 ARRY-470（对 TrkA、TrkB、TrkC 的 IC50分别为6.5、8.1和10.6 nmol/L）也可有效减轻骨癌痛和降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）表达[11-13]；Sevcik等皮下给予缓激肽B1受体选择性强效拮抗剂（LF22-0542、B6769）也可减轻骨癌痛[14]，注射抗-NGF抗体能够显著降低骨癌痛及其伴随的外周和中枢敏化的生物标记物（如 CGRP、TrkA、c-Fos等）的表达[15]，缓解 40%～70%的疼痛[16]；Halvorson等静脉注射伊班膦酸能够快速减轻骨癌痛的疼痛和中枢敏化的神经化学指标（如GFAP、c-Fos、强啡肽原等）[17]。

后来该模型也逐渐被其他研究团队所认可并使用。我国学者在该小鼠骨癌痛模型上证明脊髓Mas相关G蛋白偶联受体亚型C（Mas-related G-protein-coupled receptor subtype C，MrgC）泛素化后，可能通过降低神经元钙离子浓度而减轻骨癌痛[18]；另一研究小组在该小鼠骨癌痛模型上外源性给予L-NMMA（一种一氧化氮合成酶抑制剂）可有效降低骨癌痛[19]；随后证明了依那西普可通过降低骨癌诱导的TNF-α升高以及疼痛相关的行为[20]。以上研究表明利用NCTC2472小鼠骨肉瘤细胞股骨内孵育建立的骨癌痛模型得到了很好的应用。

不仅在股骨注射癌细胞可产生骨癌痛模型，其他部位的骨（如跟骨）也能制备骨癌痛模型。Wacnik等用 10 μL含 2×105NCTC2472骨肉瘤细胞的无菌PBS细胞悬液在近远端注射入C3H/He小鼠的跟骨，植入后第7 d开始产生机械性疼痛。在此模型上研究表明掌内注射内皮素A受体拮抗剂BQ-123可部分阻断肿瘤相关的机械性疼痛[21]；表皮神经纤维的数量随着疼痛的发生而减少[22]。然而，该小鼠骨癌痛模型可能由于操作不便等原因，并未被广泛使用。

2 前列腺癌细胞诱导的骨癌痛模型及相关研究进展

受小鼠骨肉瘤骨癌痛模型研究的启发，Mantyh团队的Halvorson等后来又将含105犬前列腺癌ACE-1细胞的20 μL Hank's溶液注射于无胸腺裸鼠的股骨骨髓腔内，率先建立了前列腺癌小鼠骨癌痛模型，在该模型上发现腹腔注射抗-NGF抗体可减轻骨癌痛，其机制可能是阻断了由NGF激活或敏化的TrkA和p75疼痛受体[23]。在另一研究中，运用该小鼠骨癌痛模型，口服给予多靶点（CSF1R、c-kit、FLT3）拮抗剂PX3397可减轻ACE-1前列腺癌细胞诱导的骨痛，镇痛效率约50%[24]。在另一个研究小组，Zhang等则在雄性大鼠胫骨内孵育另一种前列腺癌细胞AT3.1建立了骨癌痛模型，并诱发模型大鼠的脊髓GFAP和OX-42免疫荧光增强，表明星形胶质细胞和小胶质细胞被显著激活，同时手术侧脊髓星形胶质细胞IL-1β表达升高[25]。然而该前列腺癌细胞诱导的骨癌痛模型并未被广泛使用，可能是由于AT3.1前列腺癌细胞系获得较困难。

3 乳腺癌细胞诱导的骨癌痛模型及相关研究进展

英国的Medhurst等在2002年率先运用MRMT大鼠乳腺癌细胞系在大鼠胫骨外侧注射3 μL含MRMT细胞的Hank's液到骨髓腔内，10 d后产生进展性机械性疼痛，表明用该方法成功建立了大鼠骨癌痛模型[26]。Meng等用该模型研究发现骨癌痛大鼠显示了骨损坏和敏感的疼痛行为，同时在脊髓伴随白细胞浸润增加，星形胶质细胞激活、线粒体裂变-融合动力学的不平衡以及降低SIRT1（mammalian silentinformation regulator2 homolog）蛋白表达和磷酸化，并升高Drp1蛋白（dynamin-related protein 1）；鞘内注射2-溴棕榈酸酯和SIRT1激动剂SRT1720可明显减轻骨癌痛大鼠的疼痛行为，同时降低脊髓炎症，反转脊髓线粒体裂变-融合动力学的不平衡，并进一步抑制线粒体凋亡[27]。

此外，在该骨癌痛模型上发现了多种可能的镇痛靶点，如神经肽Y[28]、伤害感受素/孤儿素FQ受体系统[29]、Src激酶[30]、P2X7 受体[31]、酸敏感离子通道 3（ASIC3）[32]、GDNF[33]、赖氨酸特异性脱甲基化 酶 1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）[34]、KCNQ/M（Kv7）钾离子通道[35]、TRPV1[36]、BDNF[37]、大麻素受体[38]等

在另一个由Vanderah领导的研究小组，Lozano-Ondoua等首次将105小鼠乳腺癌66.1细胞注射入BALB/cfC3H小鼠，14 d后手术侧足爪缩脚反应阈值较对照组明显减低，表明此种方法可成功建立骨癌痛模型。在该骨癌痛模型上，系统性给予大麻素（cannabinoid）2型受体激动剂AM1241、JWH015，激动大麻素2型受体后不仅可显著减轻癌细胞增殖和炎症介质的产生、降低骨重塑，而且更为重要的是可有效减轻严重骨癌痛、骨量丢失以及癌症相关的骨折发生率[39]。在前期研究基础上，Forte等证明Ang（1-7）/MasR激活可显著减轻骨癌痛，而注射MasR拮抗剂A-779可降低其镇痛效应[40]。

2005年，我国科研团队创新性地在胫骨骨髓腔内接种Walker256大鼠乳腺癌细胞，制备了骨癌痛模型[41]。Yang等利用该模型证明骨癌导致脑脊液中ATP水平升高，脊髓小胶质细胞中P2X7受体、磷酸化p38、IL-18升高，而抑制脊髓P2X7/p-38/IL-18通路可明显降低进展期骨癌痛[42]。此外，我国另一个科研团队报道在该模型上激活脊髓GLP-1受体和α7烟碱型乙酰胆碱受体可诱发IL-10/β内啡肽的表达和释放，从而对骨癌痛产生镇痛作用[43-44]。

在该大鼠骨癌痛模型上，也证明了脊髓D-型氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）的高表达有助于骨癌痛的发生和维持，而且不管系统性还是局部鞘内给予DAAO特异性高效抑制剂CBIO（IC50=90～188 nmol/L），能够剂量依赖性地抑制胫骨内孵育Walker256大鼠乳腺癌细胞诱导的骨癌痛，最大效能为40%～50%，其机制可能是抑制脊髓过氧化氢的产生，进而抑制脊髓星形胶质细胞的活化，从而减轻骨癌痛[45]；后又在该模型上证明用钩吻碱（gelsemine）激活α3甘氨酸受体也可产生镇痛作用，最大镇痛效果为50%～60%[46]。经过国内外众多学者的验证，该模型已被广泛认可并使用，利用该模型已发现有数十种靶标分子参与骨癌痛的病理过程。2016年，Shenoy等对此进行了系统总结，新发现的靶点有TLR4、NMDA、EphB1/B2受体、DAAO等[47]。我们也率先报道了神经酰胺激酶（ceramide kinase，CerK）和鞘氨醇-1-磷酸受体 1（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1）可能是神经酰胺代谢系统中治疗骨癌痛的2个靶点分子[48]。上述许多潜在的镇痛靶点是由国内学者发现的。因此，国内学者在此领域做出了重要贡献。也由此足见，骨癌痛的发病机制极其复杂。

目前开发的骨癌痛模型有近10种，可从不同的角度对其进行分类。从动物角度主要有大鼠和小鼠模型；而从制备骨癌痛模型使用的细胞类型角度分类，主要有乳腺癌细胞系（如大鼠乳腺癌细胞MRMT和Walker256细胞系、小鼠乳腺癌细胞66.1细胞系）、前列腺细胞系（犬前列腺癌细胞ACE-1细胞系和大鼠前列腺癌细胞AT3.1细胞系）、骨肉瘤细胞系（小鼠骨肉瘤细胞NCTC2472细胞系），这几种癌种在临床上发生骨转移的概率较高。如前所述，骨转移发生概率较高的癌种中还有甲状腺癌、肺癌、胃肠道癌，但针对这几种癌种的骨癌痛模型尚未见报道。另外，从接种癌细胞的骨的部位可分为跟骨部位的骨癌痛模型、胫骨部位的骨癌痛模型及股骨部位的骨癌痛模型等3种类型。国内学者使用Walker256乳腺癌细胞胫骨内孵育制备骨癌痛大鼠模型较多，主要原因可能是由于Walker256大鼠乳腺癌细胞是悬浮细胞，获得方便，易于培养和收集；在大鼠的胫骨部位接种癌细胞比较方便，易于制备且可重复；该种骨癌痛模型能够非常好地模拟人类骨癌痛的病理学特征，与临床具有很高的相关性，这也是最重要的一点。骨癌痛动物模型的开发为阐明骨癌痛的发病机制、靶点验证奠定了试验基础，更重要的是为研发安全有效治疗骨癌痛的药物提供了新思路，具有重要且长远的社会和经济意义。