鞘内注射赛庚啶缓解小鼠骨癌痛

杭黎华，卫世有，徐振锴，蔡玥娇，李姝娜，彭生

（1.江苏大学附属昆山医院麻醉科，江苏昆山215300；2.上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻喉科，上海200092；3.上海中医药大学附属第七人民医院麻醉科，上海200137）

SET domain containing lysine methyltransferase 7／9（SET7／9）是组蛋白 H3赖氨酸4甲基转移酶，可使NF-κB、STAT3等转录因子甲基化，调控基因转录［1－2］。离体研究证实，SET7／9可通过激活 NF-κB p65，促进炎症基因的表达及炎性因子的产生［3］。多项研究证实，炎性因子与骨癌痛的产生存在着密切联系［4－5］。但是，SET7／9是否参与骨癌痛的发生目前并不明确。因此，本研究拟采用行为学实验、药理学及蛋白质印迹等方法来探讨SET7／9在小鼠骨癌痛中的作用。

1　材料与方法

1.1　动物及分组

雄性C3H／HeJ小鼠88只，体质量20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK2016-0001）。小鼠自由饮水、摄食，所有动物实验符合江苏大学实验动物伦理委员会的要求。实验分2部分：第1部分实验分为假手术组和骨癌痛组，每组8只小鼠；造模后观察骨癌痛小鼠机械痛敏阈值（paw withdrawlmechanical threshold，PWMT）及SET7／9在骨癌痛小鼠脊髓背角中的表达变化。第2部实验分为假手术组、骨癌痛组、骨癌痛＋赛庚啶10 nmol组、骨癌痛＋赛庚啶20 nmol组、骨癌痛＋SET7／9 0.2μg组、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋赛庚啶20 nmol组（鞘内注射SET7／9 30 min后鞘内注射赛庚啶）、骨癌痛＋氯苯那敏200μg组，每组8只小鼠；观察鞘内注射赛庚啶对骨癌痛小鼠痛行为学及脊髓背角SET7／9表达的影响。

1.2　小鼠骨癌痛模型的建立

按Schwei等［6］报道的方法建立小鼠骨癌痛模型。将保存于液氮罐中的NCTC 2472纤维肉瘤细胞株（美国ATCC公司）取出，迅速37℃水浴复苏，然后将其注入有培养基的离心管中，20℃低速离心5 min。细胞沉淀用培养基适当稀释后，在37℃含5%CO2的培养箱中培养。收集处于对数生长期的细胞，用α-MEM培养基悬浮肿瘤细胞，调整密度至1×107／mL，置于冰上备用。腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg／kg）麻醉小鼠后，在左膝关节处做一个长0.5～1 cm的皮肤切口，显露股骨平台；用牙科钻沿股骨长轴方向钻孔进入股骨骨髓腔，抽取NCTC 2472肿瘤细胞悬液20μL（2×105个），由钻孔向骨髓腔中缓慢注入。注射完毕后立即采用牙科汞合金封堵穿刺孔，最后缝合切口。

预实验中通过行为学、影像学及病理学等证实，该方法制模成功率在95%左右。本研究通过观察骨癌痛小鼠PWMT，证实纳入研究的样本均制模成功。假手术组小鼠于股骨骨髓腔注射生理盐水20 μL。第二部分实验于制模手术后15 d进行鞘内注射给药。

1.3　小鼠鞘内药物注射

SET7／9抑制剂赛庚啶及氯苯那敏购自上海Sigma-Aldrich公司；SET7／9蛋白为 Abcam公司产品。赛庚啶、氯苯那敏及 SET7／9均参照 Hylden等［7］的方法进行鞘内给药。右手持25μL微量注射器与脊柱上方成20°角于L5～6间隙进针，以鼠尾出现突然侧向运动为成功标志；缓慢注药，注射时间为5 s，剂量为5μL，留针10 s。预实验中，给10只小鼠鞘内注射2%利多卡因，每只5μL，小鼠均出现双后肢瘫痪，而双前肢运动正常，阻滞持续10～20 min后，双下肢活动恢复正常，表明鞘内注射部位正确。

1.4　小鼠机械痛敏阈值的检测

采用von Frey纤毛测定小鼠PWMT［8］。小鼠于测试笼中适应30 min，采用对数级数的von Frey纤毛垂直刺激小鼠左后肢足底中部，当小鼠出现快速缩足或甩足时为阳性反应，用 up-down法［9］计算50%缩足阈值。第1部分实验检测术前1 d及术后5、7、12、15 d假手术组与骨癌痛组小鼠 PWMT；第2部分实验检测鞘内给药前（0 h）及鞘内给药后1、3、6 h各组PWMT。

1.5　蛋白质印迹法检测小鼠脊髓SET7／9的表达

鞘内注射赛庚啶组脊髓背角取材时间为鞘内注射后6 h。第一部分实验假手术组、骨癌痛组及第二部分实验骨癌痛组、骨癌痛＋赛庚啶20 nmol组小鼠深麻醉后断颈处死（n＝4），冰上取小鼠左侧脊髓背角L4～6节段。溶解于裂解液中，4℃，15 000×g离心15 min，取上清液。SDS-PAGE胶垂直电泳分离蛋白，PVDF转膜45 min，5%脱脂奶粉溶液与室温孵育1 h；PBST洗膜3次，每次10 min；小鼠抗SET7／9（1∶1 000，Abcam公司）、β-肌动蛋白（1∶5 000，Sigma公司）4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗（1∶500，碧云天生物技术公司）室温孵育1 h；滴加化学发光液反应 1 min，吸干膜上的水分，暗室曝光，图片扫描。Image J软件对图片进行灰度分析。

1.6　统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。行为学数据采用重复测量的方差分析，蛋白质印迹实验数据采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　骨癌痛小鼠痛行为学改变

两组小鼠在15 d的观察期限内健康状况良好，两组小鼠术前1 d的PWMT差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，骨癌痛组手术后7，12，15 d PWMT明显降低（P＜0.05或 0.01）；与术前1 d相比，骨癌痛组术后7，12，15 d的PWMT逐渐降低（P＜0.05或0.01）。见表1。

表1　两组小鼠机械痛敏阈值的变化g，±s，n＝8

表1　两组小鼠机械痛敏阈值的变化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与术前1 d比较

手术后5 d　7 d　12 d　15 d假手术组　1.93±0.51　1.83±0.49　1.90±0.52　1.87±0.49　1.8组别　术前1 d 7±0.48骨癌痛组　1.87±0.48　1.85±0.47　1.38±0.46a　0.83±0.28b　0.51±0.21b t值0.417　0.379　0.032　0.007　0.003 0.697　0.821　5.607　9.773　12.851 P值

2.2　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表达

蛋白质印迹结果显示，术前1 d假手术组和骨癌痛组小鼠脊髓背角SET7／9的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与术后15 d假手术组或自身术前1 d相比，术后15 d骨癌痛组小鼠脊髓背角SET7／9的表达水平显著增加（P＜0.01）。见图1。

图1　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9表达变化

2.3　鞘内注射赛庚啶对造模后15 d小鼠痛行为学及脊髓背角SET7／9表达的影响

由表2可见，鞘内注射前（0 h）骨癌痛各组的PWMT均明显低于假手术组（P＜0.05）；鞘内注射赛庚啶10、20 nmol呈剂量依赖性地增加造模手术后15 d骨癌痛小鼠的PWMT，在鞘内注射赛庚啶3 h后PWMT值达最高。与鞘内注射前0 h相比，骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg组、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋赛庚啶20 nmol组及骨癌痛＋氯苯那敏200μg组在鞘内给药后1，3，6 h的PWMT均无明显变化（均 P＞0.05）。

与骨癌痛组相比，骨癌痛＋赛庚啶20 nmol组小鼠在鞘内给药6 h后脊髓背角SET7／9表达明显降低（P＜0.01）。见图2。

表2　鞘内注射赛庚啶对造模手术后15 d骨癌痛小鼠机械痛敏阈值的变化g，±s，n＝8

表2　鞘内注射赛庚啶对造模手术后15 d骨癌痛小鼠机械痛敏阈值的变化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，与同时间点假手术组比较；b：P＜0.05，与同时间点骨癌痛组比较；c：P＜0.05，与自身鞘内注射前0 h比较

组别　鞘内注射前0 h 1 h　3 h　6 h　F值　P值鞘内注射后假手术组　1.87±0.48　1.81±0.44　1.82±0.51　1.85±0.53　2.891　0.901骨癌痛组　0.50±0.18a　0.54±0.16a　0.52±0.17a　0.50±0.15a　3.142　0.974骨癌痛 ＋赛庚啶10 nmol组　0.53±0.19a　0.55±0.18a　0.96±0.24a，b，c　0.54±0.17a　3.443　0.043骨癌痛 ＋赛庚啶20 nmol组　0.51±0.17a　0.89±0.23a，b，c 1.53±0.41b，c　0.55±0.16a　4.761　0.001骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg组　0.52±0.17a　0.51±0.16a　0.53±0.17a　0.52±0.15a　2.761　0.837骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋赛庚啶20 nmol组　0.51±0.18a　0.54±0.18a　0.58±0.18a　0.52±0.16a　3.004　0.887骨癌痛 ＋氯苯那敏200μg组　0.52±0.18a　0.52±0.14a　0.53±0.14a　0.52±0.14a　2.998　0.864 F值3.681　4.207　4.539　3.740 P值0.004　0.001　0.000　0.003

图2　鞘内注射赛庚啶对骨癌痛小鼠脊髓SET7／9表达的影响

3　讨论

表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，即通过组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码 RNA调控等方式对基因的表达进行调控［10］。组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化等。研究表明，表观遗传学参与慢性疼痛的调控过程［11］。SET7／9是催化染色质组蛋白H3K4单甲基化的关键酶。Laumet等［12］研究发现，在神经病理性疼痛模型中，组蛋白甲基转移酶G9a在背根神经节中表达明显增加，鞘内注射G9a抑制剂UNC0638可明显减轻小鼠的痛觉过敏。本研究结果显示，骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表达显著增加，鞘内注射SET7／9抑制剂赛庚啶可明显减轻小鼠骨癌痛且显著降低脊髓背角SET7／9的表达水平，提示SET7／9可能参与小鼠骨癌痛的发展过程。

本实验中发现，鞘内注射赛庚啶20 nmol可明显缓解小鼠骨癌痛，鞘内预先注射SET7／9 0.2μg对骨癌痛小鼠痛行为学没有影响，但却可抵消20 nmol赛庚啶缓解骨癌痛的作用，提示SET7／9在骨癌痛中起重要作用。预实验中，我们发现鞘内注射赛庚啶60 nmol对自主小鼠的痛行为学没有明显影响，故本实验中选择赛庚啶10、20 nmol鞘内注射，应可排除赛庚啶本身的药理作用对小鼠痛行为学的干扰，使实验结果更为可靠。这一观察结果与Suh等［13］的研究相似，该研究证实鞘内注射赛庚啶0.31～62 nmol对自主小鼠痛行为学没有影响。鞘内注射是研究药物作用于脊髓的好方法［7］，但鞘内注射赛庚啶不可避免地也可作用于背根神经节。因此，本研究结果显示赛庚啶可减轻骨癌痛，也可能包含背根神经节SET7／9参与骨癌痛的外周机制。赛庚啶除了对SET7／9有抑制作用外，还有潜在的拮抗H1受体的作用。研究发现，鞘内注射足量拮抗H1受体作用的氯苯那敏 200μg［14］，对骨癌痛小鼠痛行为学没有明显影响，提示赛庚啶减轻骨癌痛主要是通过抑制SET7／9。综上所述，脊髓SET7／9可能参与小鼠骨癌痛的发展过程。

［参考文献］

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