富源某猪场高致病性蓝耳病及猪圆环病毒病的实验室检测

李华高，荀绍雄，李方志，晏 波，潘 基，马万圣，潘爱查，湛峰一，雷洪梅，赵家礼，顾绍锋，杨树林，肖玉权，陈士春

（1.富源县大河镇农业农村综合服务中心，云南 富源 655500；2.富源县动物疫病预防控制中心，云南 富源 655500；3.富源县大河镇龙泽畜禽养殖服务农民专业合作社，云南 富源 655500）

1 前言

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染所致的一种急性传染病，以繁殖障碍、呼吸系统疾病等为主要特征，主要引起母猪流产，产死胎、弱仔等临床症状，简称猪蓝耳病。蓝耳病是一种接触性的传染病，呈地方性流行，一年四季都可发病，以夏秋两季最为严重。持续性感染是蓝耳病的重要特征，PRRSV在感染猪体内存在时间长，通过血液循环引起胎猪受到感染。2022年9月份，富源某猪场部分猪只陆续出现不明高热，发病猪主要是保育猪，死亡淘汰率在20%~30%。根据临床及剖检特点，怀疑有蓝耳病或圆环病毒病的存在，而且这2种疾病会引起动物机体严重的免疫抑制，因此，检测了PRRSV和PCV2，为猪场进一步采取全面、有效的措施打下了基础，提供了方向。

2 材料与方法

2.1 实验地点和时间

本试验于2017年2—5月在云南农业大学牧医楼404实验室进行。

2.2 病料来源

2017年2月份富源大河某猪场不同时间、不同周龄发病猪的脾脏、肺脏、淋巴结等病变器官，共15份。

2.3 实验材料

2.3.1 仪器

手术剪刀、眼科剪刀、酒精灯、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子秤量器、摇床、离心管、枪头、乳胶手套等。

2.3.2 溶液及试剂

化学试剂：TE缓冲液（含RNA酶）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%乙醇。酶类：蛋白酶K、RNA酶等。电泳类试剂：1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙啶溶液（EB）、琼脂糖凝胶。

2.4 实验方法

2.4.1 PRRSV的检测

（1）病毒RNA的提取

取病料脾脏、肺脏和淋巴结病变组织，液氮研磨。应用TRIZOL Reagent细胞裂解液按常规方法提取组织总RNA，用于病毒基因组反转录和PCR扩增。提取过程中所有的器皿及消耗品均用DEPC处理，避免RNA酶的污染，给获得组织RNA带来困难。

（2）RT-PCR扩增

①在微量离心管中配制如下表1溶液，置于冰盒上混匀，37℃下静置10 min后移入 42℃水浴锅中保温 1 h。

表1 微量离心管中配制溶液

②PCR反应体系：在微量离心管中配制如下表2 DNA 溶液（置于冰盒上）。

表2 微量离心管中配制DNA溶液

③扩增DNA 片段的 PCR 反应条件如下：

（3）电泳检测

①1%琼脂糖凝胶的配制 称取1 g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100 mL TBE工作液，混匀后将该三角瓶置于微波炉加热煮沸10sec，加入20µL（约1滴）溴化乙啶（1 mg/ mL），混匀后室温降温至50℃左右。用挡板封住胶板，在固定位置放上梳子，将凝胶缓慢倒入胶板，室温下静止30 min左右，待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子。拔掉挡板，将凝胶板放入含有TBE缓冲液的电泳槽中。

②点样 取5 µL提取的动物基因组DNA，分别与适量的溴酚蓝（样品的1/5）混匀后，点入凝胶孔内。同时将分子量标记5µL（GL2000）也点入凝胶第一孔位置内。注：GL2000分子量标记分别是：2000、1600、1000、750、500、250和100bp。

③电泳 接通电源后，将电泳仪的电压调至100V，电泳1h左右，溴酚篮移动距点样孔2 cm左右，停止电泳。

④观察和拍照 将凝胶从凝胶板上取下，放到紫外观察箱中，打开紫外观察灯254 nm，可见到大分子量的动物基因组DNA。凝胶DNA的拍照采用凝胶成像仪。

（4）目的基因的纯化

将RT-PCR扩增出的目的片段胶回收，使用大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0试剂盒进行回收，将胶回收的产物送至大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）进行测序。

2.4.2 PCV2的检测

（1）病毒DNA的提取

用剪刀剪取病猪脾脏、肺脏和淋巴结组织约0.2~0.5 g于1.5 mL离心管内。加入700 mL STE液（含RNA酶），同时加入77 mL 10%SDS液（总体积1/10），用眼科剪刀剪碎组织样品。加入20 mL 蛋白酶K（20 mg/ mL），指弹混匀。70℃消化20 min后加700 mL Tri饱和酚，置脱色摇床抽提10 min。12000 r/min离心1 min，取上清液于另一1.5 mL离心管中。加700µL 酚氯仿（1：1）于离心管中，置于脱色摇床抽提10 min。12000 r/min离心1 min，取上清液于另一1.5 mL离心管中。加700 µL氯仿－异戊醇（24∶1），置于脱色摇床抽提10 min。

（2）PCR扩增

①在微量离心管中配制如下表3 DNA 溶液（置于冰盒上）。

表3 微量离心管中配制DNA 溶液

②扩增DNA 片段的 PCR 反应条件如下：

（3）电泳检测 步骤同2.4.1（3）。

（4）目的基因的纯化 步骤同2.4.1（4），将胶回收的产物送至大连宝生物（TaKaRa）公司进行测序。

3 结果

3.1 病猪的临床症状及剖检

发病猪主要是保育猪，28d断奶留床7d，后转入保育舍，在保育舍7到20d发病，病猪体温39~42℃不等，20d后慢慢稳定，死亡淘汰率在20%~30%。免疫器官全身淋巴结不同程度的肿大，特别是腹股沟淋巴结肿大明显。脾大，边缘有丘状突起以及出血性梗死灶。

3.2 PRRSV的检测

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约421bp处出现扩增条带，其大小与设计的PRRSV-F和PRRSV-R预期扩增的目的片段相一致。测序结果经比对分析，与已公布的序列相符。

3.3 PCV2的检测

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约522bp处出现扩增条带，其大小与设计的PCV2-F和PCV2-R扩增出的预期片段相一致。测序结果经比对分析，与已公布的序列相符。

4 讨论

目前，我国猪场PRRSV感染非常普遍，阳性场也很高，但并不是所有阳性场都会发生蓝耳病。同时，我国圆环病毒病感染的猪场也较多，圆环病毒病流行越来越广泛，甚至育肥猪早期也常有感染。流行引起的原因有：①圆环病毒抵抗力强，一般消毒剂无效。此病毒无囊膜，对醇、氯、碘、苯酚等有机消毒剂具有抵抗力，但能够被碱性消毒剂（氢氧化钠）、氧化剂（次氯酸钠）和季铵盐化合物灭活；②PCV2 基因变异：有PCV2a、PCV2b、PCV2d 型等；③PCV2 传播途径多，可水平传播和垂直传播；④养殖场对PCV2的免疫抑制危害认识不够。影响圆环病毒病疫苗免疫效力的因素有很多，其中，最重要的有疫苗质量、使用方法、免疫程序、猪群健康状态等，应客观、辩证地分析疫苗免疫效力。另外，PCV2母源抗体有保护作用，并且有抗体滴度依赖性。试验研究表明：未吃到初乳的仔猪更易发病；抗体水平低的母猪所产仔猪死亡率高于抗体高的母猪后代；母猪血清 PCV2含量高，其仔猪死亡率也高。因此在饲养管理中也应注意，尽量做到使仔猪比较均等摄入足量的母源抗体。

总之，需要结合猪场的实际特点，将疫苗免疫技术、闭群 200 d净化技术、生物安全控制技术、新的饲养模式、血清人工驯化技术、药物预防与保健等新技术合理地利用起来，对PRRSV和PCV2提供更为全面、有效的综合防控措施。

5 结论

本实验成功提取了病料中的RNA和DNA，采用RT-PCR、PCR方法检测出了PRRSV和PCV2，判定该猪场患病猪确为猪蓝耳病和圆环病毒病阳性。通过对PRRSV和PCV2的危害、传播特点及商品化疫苗的现状等问题进行分析，总结了猪场在PRRSV和PCV2的防控方面的有效手段，为我县养猪业更为健康地发展提供帮助。