不同方法提取卵黄抗体的对比

牛亚丽，王 萌，王亚楠

（豪威生物科技有限公司，天津 301700）

随着禽畜业的迅速发展，其规模化程度越来越高，抗生素滥用导致的细菌耐药性及抗生素残留问题也越来越突出。加快寻找和使用其他安全可靠的产品来取代抗生素成为行业亟待解决的问题。鸡源性的卵黄免疫球蛋白被认为是一类非常重要的免疫物质，其作用机制在于，可以抵御外界的病毒，并且可以促进免疫系统的正常运作[1]，其作用机制主要表现在促进免疫反应，如促进免疫系统的活性和免疫耐受性，减少病毒的传播，防止病毒的蔓延。除了具备抵御病毒感染的能力，卵黄抗体也被证实是一种非常有效的毒素抑制剂，它的稳定性极佳，特异性极强[2]，完全没毒，没有任何残余，也没有出现任何耐药现象，而且它还能够提升机体的免疫力，因而，它已经成为动物的健康监测、预防与治疗的首选手段[3]。随着卵黄抗体的持续发展，它的独特性、疗效显著超越了传统的抗生素，成为一种可以快速获得、精确分析、低毒副反应、安全可靠的新一代“抗生素”。它的出现，使得抗生素的使用更加安全、环保，在畜牧业中发挥着越来越重要的作用[4]。

在鸡蛋黄中，蛋白质和脂肪的比例通常在1∶2之间，而这些物质的组成主要由蛋白质和脂肪组成的脂蛋白。然而，这些脂蛋白很难被水解，而磷脂和不饱和脂肪酸也容易发生化学反应，从而使得抗体的有效性受到影响，因此，给动物注入发生化学反应的抗体可能会导致动物的死亡。由此去除卵黄抗体的脂蛋白和脂质是至关重要的，若无法有效地去除这些成分，将可能导致其应用于动物的免疫系统中，从而造成极其危险的后果[5]。因此，有效地去除这些成分变得至关紧迫。在这项研究中，我们使用了多种技术来提纯卵黄抗体，并对它们的优势和劣势进行了全面的评估，旨在寻求最佳的技术，并将这些结果应用于未来的生产实际[6]。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

tg16g台式高速离心机、10~100µl8道移液器、96孔V型微量板、XK96-3型微量振荡器以及北京勃林格殷格翰的高免蛋鸡，均按照常规的鸡类免疫程序进行了处理，以满足实验需求。

1.2 主要试剂

新城疫标准抗原（批号：202111、中国兽医药品监察所）、禽流感H9亚型标准抗原（批号：2021001、哈尔滨维科生物技术有限公司）、辛酸（批号：20201210、国药集团）、无水乙酸钠（批号：20211111、国药集团）、三氯甲烷（批号：20210720、天津市科密欧化学试剂有限公司）、PBS缓冲液（干粉）（批号：PM31132120、coolaber）、盐酸分析纯（批号：20190123、天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙酸分析纯（批号：20171119、天津市福晨化学试剂）、75%乙醇（批号：20221129、山东福尔特消毒制品有限公司）。

1.3 试验方法

为了确保产品的安全，我们需要对所有的鸡蛋进行处理。我们需要把它们放在42℃的0.1%新洁尔灭溶液中浸泡15 min，接着，我们需要使用75%的乙醇来彻底洗涤，以消灭它们的细菌。最终，我们需要把它们分开，分离出蛋清和蛋黄，丢弃蛋清，只保留蛋黄。接下来，我们就要按照如下步骤来提取卵黄抗体[7]。

（1）酸化水提取法：将卵黄和纯化水按照1∶8的体积混合，即1 mL卵黄+8 mL纯化水，震荡均匀，用20%的稀盐酸调节pH值为5.2，4℃静置6h，然后4℃、10000 r/min离心25 min，弃掉沉淀，收集上清液即可[8]。

（2）氯仿萃取法：将卵黄和PBS缓冲液（pH7.5）按照1：8的体积混合，再加入同体积的三氯甲烷。即1 mL卵黄+8 mLPBS缓冲液，混合均匀，加入9 mL三氯甲烷，振荡均匀，4℃、10000 r/min离心30 min，取上层清液即可[9]。

（3）将卵黄液和乙酸钠缓冲液按1∶8的比例混合，1 mL卵黄液和8 mL乙酸钠缓冲液混匀，再加入25%的辛酸，搅拌30 min，最后以6000 r/ min 的速度离心20 min。将沉淀物抛弃，取出上层清澈的液体[10]。

（4）安检试验：我们从10日龄的SPF鸡中挑选出40只，将它们随机地划分到4组，其中第3组接受免疫，第4组作为对照。我们将SPF鸡按顺序接种卵黄抗体，而另一组接种了与之相当的生理盐水，最终将它们置于相同的环境中，通过14d的持续监测，以确保实验结果的准确性。

（5）抗体效价检测

①血凝试验：将96孔的微量板放置，从第1孔到第12孔中添加0.1MPBS 0.025 mL，在第1孔中添加0.025 mL的血凝素标准抗原，接着按顺序进行2倍的稀释，一直到第12孔。弃去第12孔的稀释液，并设置红细胞对照孔，然后从第1孔到第12孔加入1%鸡红细胞悬液0.025 mL，在振荡器上混合均匀后，在10~30℃的环境下，静置20~40 min，到对照孔中的红细胞呈显著纽扣形态，即可确认结果，使其100%的凝集的稀释度，确认为其凝集价。

②血凝抑制试验：通过血凝素的凝集价，我们可以确定4HAU抗原。如果我们的凝集价值是1∶1024，那么我们可以得出4HAU抗原是1∶256。将1 mL血凝素和9 mL缓冲液混合在一起，使其成1∶10稀释的混合液，取1∶10稀释液1 mL添加至24.6 mL 0.1 Mol/L PBS缓冲液中，以达到1∶256的浓度。将待检样品取出，在96孔微量板分别标记待检样品、病毒对照、红细胞对照，取出3个加样槽，分别标记0.1 mol/LPBS、4HAU、1%鸡红细胞悬液。从第1孔至第12孔，在待检样品组及病毒对照组中，每孔加入0.1 mol/LPBS 0.025 mL，红细胞对照组每孔加入0.1 mol/LPBS 0.05 mL，使用移液器将被检样品混合均匀，然后加入第1孔中，进行2倍背比稀释，稀释倍数依次为2、4、8、16...和4096孔，将4HAU的血凝素和1 %的鸡红细胞悬液分别添加到待检的样本和病毒对照的试验孔内，并将其放置于微量振荡器震荡均匀，在10~30℃的环境温度下放置20~40 min。然后每孔再加入1%鸡红细胞悬液0.025 mL，同样的环境温度下放置20~40 min，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时即可开始判定结果。使红细胞100%凝集抑制的样品最高稀释度为判定终点（凝集抑制价）。

2 结果与分析

（1）通过本次实验，我们发现，不同的提取方法会导致卵黄抗体的物理性质发生变化。我们通过观察提取液的颜色、气味、透明度和体积，发现这些变化。具体情况可以参考表1和表2。

表1 使用不同方法提取卵黄抗体时的物理特征

表2 3种方法提取卵黄抗体的体积

由表1可知，酸化水提取的卵黄抗体具有良好的透明度，而辛酸法提取的卵黄抗体则存在一定的气味，其中以氯仿法的效果最佳，但也会带来一股刺鼻的氯仿气味。由表2可知，本试验采取的3种提取卵黄抗体的方法中，用相同体积的卵黄原液，以氯仿萃取法提取的卵黄抗体量最多，其次为酸化水提取法，而辛酸法提取的抗体量最少。

（2）安检试验：通过观察SPF鸡的存活情况，发现14 d后，3组免疫鸡与对照组SPF鸡一样，均存活。这一情况表明，通过3种不同提取方法得到的卵黄抗体均对动物机体无毒害作用，安全可靠。

（3）通过对3种不同提取方法获得的卵黄抗体进行血凝抑制试验，我们发现它们的抗体效价存在显著差异，具体情况可参见表3。

表3 3种方法提取卵黄抗体效价的对比

由表3可知，本试验采取的3种提取卵黄抗体的方法中，氯仿萃取法得到的抗体，无论是新城疫还是禽流感，其效价最高，酸化水提取法略低于氯仿萃取法，而辛酸法的抗体效价最低。

3 小结与讨论

在这项研究工作中，本课题组认为氯仿萃取法在提炼卵黄抗体时具有显著的优势，它的提取速度快，体积大，溶解度良好，但是萃取剂三氯甲烷具有潜在的危险，可导致严重的副反应，包括呕吐、消化不良、食欲不振和神经系统症状，甚至可能导致病变。由于抗体的残留可能会给动物的健康带来潜在的危险，所以，应当采取措施避免这些情况的出现。此外，研究发现，抗体的残余可能影响酶标板的吸附能力，从而使得ELISA检测出现伪阳性，从而影响最终的诊断精度。酸化水提取法的提取率仅次于氯仿萃取法，且物理性状较好，虽然抗体效价略低，但是后期如果用于生产，可以在生产过程中采用超滤浓缩技术，即可提高卵黄抗体效价。尽管辛酸法的抗体提取效率不高，抗体数量较少，抗体效价也不及其他两种技术，然而，根据相关研究，它能够更加准确地清除卵黄脂类，并且由于辛酸的溶解度很高，因此，它的残留量几乎可以忽略不计，对动物机体不会造成毒害作用[11]。

经过系统的研究，酸化水提取法在提取卵黄抗体方面具备了许多优势：操作简便、提取效果显著、提取质量优良、化学试剂消耗量小、提取过程中没有任何危害，而且提取出来的抗体质量更加稳定，并且提取过程也更加便捷，提取的卵黄抗体质量更加优良，因此，它具备了大范围的应用前景。同时辛酸法去除脂类效果好，故而综合考虑，酸化水提取法结合辛酸法是大规模生产最好的选择[12]。

4 展望

根据农业农村部194号公告，规定了从2020年元旦开始，我们将严格禁止饲料中抗生素的使用，以防止抗生素的过度使用带来的危害。卵黄抗体是一种更具安全性、可靠性和疗效的抗菌剂，近年来已经被广泛地运用于生物技术、医疗保健和食品工业[13]。卵黄抗体具备的优点有以下几个方面：①制备原材料简单、只需收集高免蛋即可，无需采血，对实验动物机体不会造成伤害[14]。②免疫蛋鸡的饲养成本相对较低，只需要少量的资源，就能够获得高品质的特异性卵黄抗体。③抗体的制备过程也相对简单，无需使用复杂的仪器设备，因此生产成本也相对较低。④由于不与蛋白A、G和Fc受体结合，因此在进行免疫学检测时，可以避免出现错误的结果。保证检测结果准确性[15]。⑤卵黄抗体化学性质稳定、耐热、耐酸，在60℃巴氏灭菌温度下活性不会下降，在室温下可存放4个月，2~8℃可存放数十年也不会失去活性。⑥安全、高效、无公害、不受地域和季节的限制，使用方便。基于以上的诸多优点，卵黄抗体已被开发成功能性食品、消毒剂及其他产品等，例如：作为食品添加剂以及饲料添加剂等[16]。尽管卵黄抗体的应用范围越来越广，但是目前尚未建立起一套完善的标准化流程和质量控制体系，同时也存在着生产工艺的不稳定性等诸多挑战。然而，随着卵黄抗体技术的持续改进和研究，以及生产方法的持续优化，卵黄抗体的应用前景将变得更加光明[17]。