PM2.5 短期暴露诱导免疫耐受缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用研究①

韩 冰 赵卓华 申玉霞 张 言 徐 妍 张 媛 （陕西师范大学生命科学学院，西安 710119）

近年大气污染对人群健康的影响已成为全球重要公共卫生问题。大气污染物中的可吸入式悬浮细颗粒物是影响空气质量的关键指标，也是大气污染影响健康的重要物质基础［1］。不断增多的流行病学证据表明，暴露于大气中的PM2.5 会加重糖尿病（diabetes mellitus，DM）、类风湿关节炎（rheumatic arthritis，RA）和多发性硬化（multiple sclerosis，MS）等自身免疫病［2-3］。PM2.5 暴露会诱导机体炎症因子失衡，引起炎症反应［4-5］。本团队前期通过遗传、细胞和药理学等手段建立了长期PM2.5 暴露通过TLR-4/NF-κB 信号通路诱导小胶质细胞活化加剧神经炎症和髓鞘损伤的“PM2.5 暴露-细胞效应-健康危害”全链条证据［6］。但随着研究的深入，课题组发现PM2.5 的致病作用与其暴露时间窗、质量浓度、粒径、化学组分密切相关，具有异质性，其致病机制的普适性和特殊性有待长期观察和系统评估。O'DRISCOLL 等［7］报道低剂量PM 暴露以依赖芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）的方式抑制病理性T细胞反应，从而减轻神经炎症发作，也证实了PM2.5 生理作用的复杂性。在研究PM2.5 与自身免疫病相关性的前期工作中，课题组发现了一个现象：与持续PM2.5暴露显著加剧成年小鼠EAE 病理作用相反，短期PM2.5 暴露可有效延迟小鼠神经炎症发生和发展，显著降低了临床评分累积和峰值，推测可能与PM2.5 诱发机体免疫耐受相关，但这一“时间窗”效应的作用机制尚不清楚，无法进行针对性药物干预。

本研究旨在探究短期PM2.5 暴露对小鼠EAE的影响，并探讨其潜在作用机制，以期为预防和解决空气污染造成的健康效应提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级6～8周龄雌性C57BL/6品系小鼠购自陕西师范大学实验动物中心，在标准条件下饲养，温度（23±2） ℃，所有实验程序和方案均经陕西师范大学动物实验伦理委员会批准（伦理批号：202312013），并按照批准的机构指南和法规进行。MOG35-55多肽（Genescript，Piscataway）；百日咳毒素（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；SRM1648A（Sigma）；O.C.T.包埋剂（Tissue-Tek， Sakura Finetek）；Fluoromyelin（Abcam，Cambridge）；CD45、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD80、CD86、IL-17、IFN-γ 和Foxp3 抗体（BD Biosciences，San Jose，CA）。

1.2 方法

1.2.1 EAE 模型制备 PBS 溶解MOG35-55多肽，与等体积完全弗氏佐剂（含5 mg/ml 结核分枝杆菌）混合，玻璃注射器推打至油包水状的白色抗原乳剂。在小鼠背部两个位点皮下注射免疫，免疫当天和2 d后分别腹腔注射百日咳稀释液（200 ng/只）。免疫完成后每天对小鼠进行EAE 评分，测量体质量变化并记录。

1.2.2 PM2.5 的来源及制备 大气污染物组成复杂，单一成分暴露不能较好地模拟多种污染物共存的实际大气污染环境对人群健康的影响，因此本研究选择大气细颗粒物混合物进行各项实验。但由于PM2.5 的毒性与其来源和组成密切相关，为保证实验的代表性和重复性，本研究选择NIST标准品库来源的商品化城市大气微颗粒物SRM1648A进行实验。该标准参考物主要成分（多环芳烃、多氯联苯同类物、氯化农药和大气颗粒物质等）已由NIST 标准品库提供了定性定量分析报告。在无菌PBS中超声处理15 min，制备SRM1648A分散混悬液。

1.2.3 实验分组和给药 PM2.5 暴露组：造模前3 d至造模后2 d，每天接受1次PM2.5［5 mg/（kg·d）］鼻咽吸入。PBS 组：同周龄小鼠接受相同时间PBS鼻咽吸入。

1.2.4 组织染色及病理评估 取造模第30 天小鼠，心脏灌注固定，取脊髓腰骶膨胀，室温下立即用4%多聚甲醛固定24 h。其他组织用30%蔗糖溶液4 ℃脱水48 h 后用O.C.T.包埋剂包埋制作冰冻切片，使用Fluoromyelin 进行免疫荧光组织化学染色，髓鞘密度定量：手动选择总白质区域，Image-Pro Plus 软件计算脱髓鞘面积（%）。HE 染色评估炎症，LFB染色评估脱髓鞘。双盲法对切片进行炎症评估和评分：0 分，无炎症细胞浸润；1 分，脊髓实质轻度炎症细胞浸润；2分，脊髓实质中度炎症细胞浸润；3分，脊髓实质重度炎症细胞浸润。髓鞘脱失评分：0 分，无髓鞘脱失；1分，1～3个髓鞘脱失；2分，大范围髓鞘脱失；3分，大范围髓鞘脱失且累及20%白质区域。

1.2.5 流式细胞术 分离小鼠脾细胞和CNS 单个核细胞（mononuclear cell，MNC），将细胞与CD45、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD80 和CD86 抗体在冰上孵育30 min，进行表面标记染色。表面染色、固定、透化，IL-17、IFN-γ 或Foxp3 抗体进行细胞内染色，上机检测。

1.3 统计学处理 使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。数据表示为±s，通过方差分析（ANOVA）和t检验分析数据。所有统计分析均以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PM2.5 短期暴露显著延迟EAE 发生发展 与PBS 对照组相比，PM2.5 短期暴露可延缓EAE 发生并显著降低疾病严重程度（P＜0.01，图1A、B），但两组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05，图1C）。HE染色及LFB染色结果显示，PM2.5短期暴露组小鼠炎症细胞浸润和脱髓鞘程度显著低于PBS对照组（P＜0.05）。Fluoromyelin 免疫染色结果显示，PM2.5短期暴露组EAE 小鼠胼胝体脱髓鞘面积明显低于PBS 对照组（P＜0.001，图1D、E）。提示短期PM2.5暴露显著抑制炎症细胞浸润和髓鞘脱失，PM2.5 短期暴露可能通过抑制CNS 炎症减少脱髓鞘损伤，进而抑制EAE发展。

图1 PM2.5短期暴露显著延迟EAE发生发展Fig.1 Short-term exposure to PM2.5 significantly delays onset and development of EAE

2.2 PM2.5 短期暴露抑制EAE 小鼠CNS 炎症 与对照组相比，PM2.5 短期暴露小鼠CNS 中CD45+白细胞、激活的巨噬细胞（CD11b+TNF-α+）（P＜0.01）和活化的树突状细胞（CD11c+CD80+和CD11c+CD86+）（P＜0.001）比例和数量明显降低（图2），CD4+Foxp3+（P＜0.001）Treg和具有致病性的CD4+IL-17+（P＜0.001）Th17 细胞被显著抑制，致病性的CD4+IFN-γ+（P＞0.05）Th1 比例也有所下降（图3），提示短期PM2.5暴露通过减少CNS 炎症细胞数量从而抑制神经炎症缓解疾病发展。

图2 PM2.5短期暴露抑制EAE小鼠CNS炎症Fig.2 Short-term exposure to PM2.5 suppresses CNS inflammation in EAE mice

图3 PM2.5短期暴露抑制致病性Th17细胞Fig.3 Short-term exposure to PM2.5 inhibits pathogenic Th17 cells

2.3PM2.5 短期暴露抑制EAE 小鼠外周炎症 免疫后第30天收集EAE小鼠脾细胞，流式细胞术评价PM2.5 短期暴露对小鼠外周炎症细胞的影响，结果显示，与对照组相比，PM2.5 短期暴露组小鼠脾脏CD4+T 细胞（P＞0.05）和Th1（CD4+IFN-γ+）细胞（P＞0.05）比例差异无统计学意义，Th17（CD4+IL-17+）细胞比例（P＜0.000 1）显著降低（图4），表明短期PM2.5暴露抑制EAE小鼠外周炎症反应。

图4 PM2.5短期暴露抑制EAE小鼠外周炎症Fig.4 Short-term exposure to PM2.5 suppresses peripheral inflammation in EAE mice

3 讨论

随着工业化进程飞速发展，全球环境污染日趋严重，自身免疫性疾病发病率显著上升，城市空气中悬浮的大量高浓度微颗粒物是雾霾致病的重要物质基础［8］。多项流行病学研究共同指出空气污染程度与MS 复发和恶化显著相关［9-10］，但PM2.5 对疾病发生作用的复杂性和异质性有待深入研究。PM2.5 暴露与自身免疫病相关性研究发现：与高浓度持续PM2.5 暴露显著加剧成年小鼠神经炎症的病理作用相反，短期PM2.5 暴露可有效延迟小鼠神经炎症发生发展，显著降低了临床评分累积和峰值。与PBS 对照组相比，接受短期鼻腔滴注PM2.5的小鼠CNS 中炎症细胞浸润及脱髓鞘病灶显著减少，致病性Th1 及Th17 细胞分化和促炎细胞生成被抑制，耐受性Treg 募集增加，提示短期PM2.5 暴露可能诱发机体免疫耐受。研究报道感染性病原体可通过机体免疫耐受抑制过敏和自身免疫性疾病［11-12］。灭活病毒疫苗就是采用少量灭活的完整而无致病性的病毒颗粒引起生物系统免疫，从而产生免疫记忆预防相关疾病。食物中少量病原体微生物可诱发人体免疫应答而不致病，反而增强人体免疫力。研究表明细菌内毒素LPS 可通过结合TLR4激活下游核转录因子NF-κB 等信号传导途径，导致一系列促炎细胞因子表达升高，出现炎症损伤［13］；而ELLESTAD 等［14］发现幼鼠出生后3 d 和5 d 进行短期LPS 暴露，可显著降低成年大鼠EAE 发病率和严重程度。本课题组前期研究发现PM2.5 在激活炎症细胞方面具有类LPS 作用，通过TLR-4/NF-κB信号通路诱导小胶质细胞激活加剧神经炎症和脱髓鞘损伤，提示TLR-4/NF-κB 信号轴可能是PM2.5发挥作用的主要通路。表明人体免疫系统在少量病原体刺激下产生免疫应答而产生“训练”效果，对该种病原体产生免疫耐受，与课题组观察到的PM2.5暴露与疾病发展“时间窗”效应相符。

尽管临床上使用短期PM2.5 暴露实现疾病治疗不可行，但阐明这一病理现象的作用机制有助于更深入了解疾病发生机制，从而寻找有效治疗靶点和进行相应药物干预。本研究显示，PM2.5 短期暴露抑制了EAE 发生发展，并显著降低了炎症细胞浸润和髓鞘脱失，短期暴露于PM2.5 的EAE 小鼠CD45+白细胞绝对数显著减少，对激活的小胶质细胞、树突状细胞及致病性Th17 细胞均有抑制作用。提示短期PM2.5 暴露通过抑制炎症反应、诱导免疫耐受而缓解疾病。

综上，本研究观察到短期PM2.5 暴露可显著抑制EAE 进程、炎症细胞浸润和髓鞘脱失，PM2.5 通过减少CNS 炎症因子并抑制EAE 小鼠外周炎症从而阻断脱髓鞘，进而抑制EAE 发展。后续研究将聚焦于探索短期PM2.5 暴露诱导免疫耐受这一“时间窗”效应的具体作用机制，为阐明MS 和其他自身免疫病的发病机制、寻找新的治疗靶点提供依据。