miR-373 调控JAK3/STAT6 信号通路抑制肿瘤相关巨噬细胞M2 极化对肺癌细胞的影响

张雅丽 周 芬 （唐山市工人医院呼吸内科，唐山 063000）

肺癌的病死率居恶性肿瘤首位，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%，是肺癌最常见的病理类型［1］。由于肺癌的复发性和转移性，患者五年生存率仅为18%［2］。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是肿瘤微环境中免疫细胞的主要组成，与肿瘤浸润和患者不良预后密切相关［3］。TAMs 能够分化为两种不同的表型。经典激活途径产生M1 型TAMs（M1-TAMs），M1-TAMs 能够分泌干扰素-γ（interferon γ，IFN-γ）和促炎细胞因子，通过抗原呈递促进肿瘤溶解［4］。旁路激活途径产生M2型TAMs（M2-TAMs），M2-TAMs 通过促进癌细胞增殖、侵袭、转移及血管形成等加快肿瘤进展［5］。酪氨酸蛋白激酶/信号转导及转录激活因子（janus protein tyrosine protein kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路在M1/M2型巨噬细胞极化中起关键作用，STAT6 是M2-TAMs激活过程中IL-4 介导免疫反应的关键因素；抑制STAT6 信号通路能够诱导M2-TAMs 转变为M1-TAMs［6］。此外STAT6 能够调节M2-TAMs 相关特异基因如精氨酸酶-1（arginase 1，Arg1）、甘露糖受体C型-1（mannose receptor C1，Mrc1）、抵抗素样α（resistin like α，Retnla）（Fizz1）和几丁质酶样3（chitinase like 3，chil3）（Ym1）的表达［7-8］。研究发现阻断IL-4和IL-13 介导的STAT6 磷酸化，能够降低巨噬细胞的M2 型极化，从而提高乳腺癌细胞的放射敏感性，并降低细胞耐药性［9］。研究表明miR-373 在肺癌组织中表达下调，发挥抑癌基因作用［10］。上调miR-373 表达能够促进肺癌A549 细胞凋亡，抑制细胞迁移［11］。然 而miR-373 与JAK3/STAT6 信 号 通 路 及M2-TAMs的关系未见报道。

因此，本研究通过A549、H1299 细胞和肺癌移植瘤裸鼠模型，探究miR-373调控JAK3/STAT6 信号通路抑制TAMs向M2极化对肺癌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6 周龄体质量20～22 g 的SPF 级雄性BALB/c 裸鼠30 只［北京唯尚立德生物科技有限公司，SCXK（京）2021-0010］。饲养于室温22～25 ℃、标准湿度50%～60%、每天12 h 光照环境中，正常饮水饮食。本研究经过唐山市工人医院伦理委员会批准（20210512）。

1.1.2 主要试剂和仪器 萤火虫荧光素酶标记的肺癌细胞A549、H1299（中国科学院上海细胞生物学研究所）；人单核细胞THP-1（武汉普诺赛生命科技有限公司）；佛波酯、脂多糖、IL-4、IFN-γ（美国Sigma 公司）；JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6（英国Abcam 公司）；CD68、CD206、IL-10 抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；miR-373、Mrc1、Arg1、Fizz1、Ym1、IL-10、CCL2 引物（上海华大基因科技有限公司）；组织切片机（德国Leica 公司）；酶标仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；Bio-Rad蛋白电泳仪、转膜仪（美国伯乐公司）。

1.2 方法

1.2.1 M1/M2-TAMs 的诱导分化 THP-1 细胞加入佛波酯（100 ng/ml）培养24 h，诱导为M0-M。加入脂多糖（100 ng/ml）和IFN-γ（20 ng/ml）培养24 h，诱导为M1-M。加入IL-4（100 ng/ml）培养24 h，诱导为M2-M。细胞共培养：利用Transwell 系统，将M0-M、M1-M、M2-M 接种于Transwell 小室中，将小室置于接种A549 细胞的6 孔板中共培养48 h，获得M0-TAMs、M1-TAMs、M2-TAMs。

1.2.2 M0/M2-TAMs 的转染与分组 根据LipofectamineTM3000 说明书分别将pHRi-miR-NC、pHRimiR-373 转 染M0/M2-TAMs，记 作M0+miR-NC 组、M0+miR-373 组、M2+miR-NC 组、M2+miR-373 组。转染4 h 后更换培养基，24 h 后通过RT-qPCR 检测是否转染成功。

1.2.3 免疫荧光染色检测TAMs CD68 水平 取各组TAMs，经4%多聚甲醛固定、0.3%TritonX-100 的5%BSA 封闭、CD68 一抗（1∶400） 4 ℃孵育过夜、次日二抗孵育1 h、DAPI染色、荧光淬灭、中性胶封片，显微镜下观察荧光染色的细胞。

1.2.4 流式细胞仪检测TAMs CD86、CD206水平取各组TAMs，PBS 洗涤3 次，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗涤3 次，加入0.1%Triton 通透10 min，PBS 洗涤3 次，加入CD86、CD206 抗体，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤3次，重悬细胞，用流式细胞仪检测CD86、CD206表达。

1.2.5 靶标预测及双荧光素酶实验 使用Targetscan 数据库预测miR-373和JAK3的结合位点，分别构建野生型质粒psi-CHECK-JAK3-WT 和突变型质粒psi-CHECK-JAK3-MUT。利用LipofectamineTM3000分别将两种质粒与miR-373 mimic、mimic NC混合物转染至A549、H1299 细胞，转染48 h 后检测荧光素酶活性。

1.2.6 RT-qPCR检测TAMs miR-373、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX2、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、IL-10 mRNA 及A549、H1299 细胞JAK3、STAT6 mRNA 水平 采用Trizol 试剂从TAMs 和A549、H1299 细胞中提取总RNA 并反转录为cDNA，使用SYBR Green 法进行扩增，U6、GAPDH 作内参。使用2-ΔΔCt公式计算miR-373、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX2、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、IL-10、JAK3、STAT6 mRNA 相对表达水平。PCR 引物序列：miR-373-F：5'-TGCGGGACATTCAGA-3'，miR-373-R：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；IL-1β-F：5'-AGATCATTTACACAATGC-3'，IL-1β-R：5'-TAAAGTCACCAAAAGGCT-3'；TNF-α-F：5'-GGACCTGCCCTTTGCTGACA-3'，TNF-α-R：5'-AGGCTGATTCTTCCGTTCTTCTTG-3'；iNOS-F：5'-GAAGGGAGAGGAGAGGAGCATCTG-3'，iNOS-R：5'-GTGGTGTGGCTGGGTAAGGAAATAG-3'；COX2-F：5'-GGGTTGCTGGTGGTAGGAATGTTC-3'，COX2-R：5'-CTGGTATTTCATCTGCCTGCTCTGG-3'；Mrc1-F：5'-TGGAAGGGGACATGTCTAGC-3'，Mrc1-R：5'-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3'；Arg1-F：5'-TGCGGGACATTCAGA-3'，Arg1-R：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；Ym1-F：5'-TGGAAGGGGACATGTCTAGC-3'，Ym1-R：5'-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3'；Fizz1-F：5'-TGCGGGACATTCAGA-3'，Fizz1-R：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；IL-10-F：5'-TGGAAGGGGACATGTCTAGC-3'，IL-10-R：5'-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3'。

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖能力 将A549、H1299细胞接种于96 孔板，细胞贴壁后更换为TAMs 条件培养基，培养1 d、2 d、3 d 后，更换成含10% CCK-8溶液的新鲜培养基，37 ℃下孵育1 h。检测450 nm处的吸光度。

1.2.8 划痕实验检测细胞迁移能力 将A549、H1299细胞接种于6孔板，其中放置含各组TAMs的Transwell小室，当细胞单壁生长时划痕，用PBS去除划掉的细胞，记录划痕宽度，培养24 h 后再次记录划痕宽度，计算划痕愈合率。

1.2.9 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 Transwell 小室平铺一层基质胶，上室加入A549、H1299细胞，下室加入各组TAMs条件培养基，37 ℃下孵育24 h。经甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜下对穿膜细胞进行观察和统计。

1.2.10 Western blot 检 测 细 胞Ki67、MMP-2/9、JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6 水 平 取 各 组A549、H1299 细胞，提取、测定并分离蛋白，转至PVDF 膜，用脱脂牛奶封闭2 h，分别加入Ki67、MMP-2/9、JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6 一抗（1∶2 000）4 ℃过夜，二抗（1∶10 000）4 ℃孵育2 h，ECL 显色剂显色，凝胶成像仪拍照，分析各组蛋白相对表达量。

1.2.11 动物实验 30 只裸鼠随机分为miR-NC 组（转染pHRi-miR-NC 的A549 细胞）、miR-373 组（转染pHRi-miR-373 的A549 细胞），每组各15 只。尾静脉注射已转染慢病毒的A549 细胞悬液（0.2 ml 1×107个/ml）。1 次/3 d，共10 次。30 d 后处死裸鼠。①裸鼠经异氟烷麻醉后，腹腔注射D 荧光素（30 mg/kg），10 min 后用体内成像系统监测裸鼠荧光。②各组随机取5 只裸鼠肺组织，制作石蜡切片，HE 染色观察肺组织病理变化。③免疫组化检测肺组织CD31、VEGFA 表达。④免疫荧光染色检测CD31、VEGFA、F4/80、CD206 表达。⑤各组取5 只裸鼠肺组织，RT-qPCR 检测肺组织miR-373、JAK3、STAT6 mRNA 水平。⑥各组取5 只裸鼠肺组织，Western blot 检 测CD31、VEGFA、Arg1、Mrc1、Ym1、Fizz1、IL-10、CCL2、JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6水平。

1.3 统计学分析 数据分析应用软件SPSS16.0，计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 M1/M2-TAMs 的诱导分化 免疫荧光染色结果显示，CD68 表达增加，M1-TAMs 细胞伸长，M2-TAMs 细 胞 呈 圆 形，证 实THP-1 向TAMs 分 化（图1A）。流式细胞术结果显示，M1-TAMs 标志物CD86 表达增加，M2-TAMs 标志物CD206 表达增加（图1B）。RT-qPCR结果显示，M1-TAMs特征性基因IL-1β、TNF-α、iNOS 和COX2 mRNA 表达明显升高（P＜0.05）；M2-TAMs 特征性基因IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1 mRNA 表 达 明 显 升 高（P＜0.05）；M2-TAMs中miR-373表达明显降低（图1C～E）。

图1 M1/M2-TAMs的诱导分化Fig.1 Induced differentiation of M1/M2-TAMs

2.2 miR-373 抑制TAMs 向M2 型极化 流式细胞术结果显示，miR-373 降低了M2-TAMs 标志物CD206 表达，而对M1-TAMs 标志物CD86 表达无影响（图2A）。免疫荧光染色结果显示，miR-373 降低了Arg1 表达（图2B）。与M0+miR-NC 组相比，M0+miR-373 组miR-373 水 平 明 显 升 高，M2+miR-NC 组miR-373水平明显降低；与M2+miR-NC 组相比，M2+miR-373 组miR-373 水平明显升高（P＜0.05，图2C）。RT-qPCR 结果显示，miR-373 降低了M2-TAMs 特征性基因IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、CCL2 mRNA表达（P＜0.05），而对M1-TAMs 特征性基因IL-1β、TNF-α、iNOS 和COX2 mRNA 表达无影响（P＞0.05，图2D～E）。

2.3 miR-373 抑制体外肺癌细胞增殖、侵袭和转移 CCK-8、划痕实验及Transwell 实验结果显示，与M0+miR-NC 组相比，M2+miR-NC 组细胞培养3 d 后的OD 值明显升高，划痕愈合率及细胞侵袭数明显增加（P＜0.05）；与M2+miR-NC 组相比，M2+miR-373组细胞3 d 后的OD 值明显降低，划痕愈合率及细胞侵袭数明显减少（P＜0.05，图3A～E）。Western blot结果显示，与M0+miR-NC 组相比，M2+miR-NC 组细胞Ki67、MMP-2/9 表达水平明显升高（P＜0.05）；与M2+miR-NC 组 相 比，M2+miR-373 组 细 胞Ki67、MMP-2/9表达水平明显降低（P＜0.05，图3F～G）。

图3 miR-373体外抑制肺癌细胞增殖、侵袭和转移Fig.3 miR-373 inhibits proliferation， invasion and metastasis of lung cancer cells in vitro

2.4 miR-373 抑制体内肺癌进展 各组移植瘤随时间推移不断生长，光子强度不断增强。第10 天，miR-373 组与miR-NC 组荧光值无明显差异，第20、30 天，miR-373组荧光值明显降低（图4A）。miR-NC组肺组织颜色发白，质地较硬，体积大，结节多；与miR-NC 组相比，miR-373 组肺组织体积明显变小，结节变少（P＜0.05，图4B～C）。HE 染色结果显示，肿瘤细胞多呈圆形、核分裂相且核深染（图4D）。免疫组化染色、免疫荧光染色和Western blot 结果显示，与miR-NC 组 相 比，miR-373 组 肺 组 织CD31、VEGFA蛋白水平明显降低（P＜0.05，图4E～H）。

Note：A.Flow cytometry result； B.Immunofluorescence staining； C～E.The expression of characteristic genes of M1/M2-TAMs and miR-373 level.Compared with M0+miR-NC group， *. P＜0.05； compared with M2+miR-NC group， #.P＜0.05.

图4 miR-373体内抑制肺癌进展Fig.4 miR-373 inhibits lung cancer progression in vivo

2.5 miR-373 抑制肺组织TAMs 向M2 型极化 免疫组化染色和免疫荧光染色结果显示，与miR-NC组相比，miR-373 组肺组织M2-TAMs 标志物CD206表达明显减少，而TAMs 标志物F4/80 表达无明显差异（图5A、B）。Western blot 结果显示，与miR-NC 组相比，miR-373 组肺组织M2-TAMs 特征性基因IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、CCL2 蛋白水平明显降低（P＜0.05，图5C、D）。

图5 miR-373抑制肺组织TAMs向M2型极化Fig.5 miR-373 inhibits M2 polarization of TAMs in lung tissue

2.6 miR-373 抑 制JAK3/STAT6 信 号 通 路 TargetScan 结 果 显 示，miR-373 与JAK3 存 在 结 合 位 点（图6A）。荧光素酶报告基因实验显示，与miR-NC组相比，miR-373 组野生型JAK3 荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而突变型JAK3 荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05，图6B、C）。RT-qPCR 和Western blot 结果显示，在A549、H1299 细胞中，与M0+miRNC 组相比，M2+miR-NC 组细胞JAK3、STAT6 mRNA和p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋白水平明显升高（P＜0.05）；与M2+miR-NC 组相比，M2+miR-373组 细 胞JAK3、STAT6 mRNA 和p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋 白 水 平 明 显 降 低（P＜0.05，图6D～G）。在肺组织中，与miR-NC 组相比，miR-373组肺组织JAK3、STAT6 mRNA 和p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋 白 水 平 明 显 降 低（P＜0.05，图6H～J）。

图6 miR-373抑制JAK3/STAT6信号通路Fig.6 miR-373 inhibits JAK3/STAT6 signal pathway

3 讨论

肿瘤微环境中，M2-TAMs 能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成，从而加快癌症进展。越来越多的研究表明miRNA 在肺癌中发挥重要作用。如miR-21-5p 能够促进小鼠体内TAMs 向M2型极化，增强体内肿瘤生长、癌细胞增殖及肿瘤内血管 生 成［12］。M2-TAMs 通 过 提 高miR-155 和miR-196a-5p 水平，促进肺癌转移［13］。本研究显示，miR-373 在M2-TAMs 中水平降低；在A549 和H1299 细胞中，过表达miR-373能够抑制TAMs向M2型极化；过表达miR-373 后，细胞增殖、侵袭和迁移能力降低。同时在移植瘤裸鼠模型中也发现miR-373能够抑制TAMs 向M2 型极化；同时能够抑制肿瘤血管生成。说明miR-373通过抑制TAMs向M2型极化对肺癌细胞发挥作用。

M2-TAMs 与肿瘤的浸润转移密切相关。Ki67是一种增殖相关的核抗原，可以反映细胞增殖活性［14］。MMP-2/9 能够降解细胞外基质，直接影响癌细胞的迁移和侵袭能力［15］。肿瘤微环境中的TAMs通过分泌促血管生成因子（如CD31和VEGFA）促进血管生成［16］。研究发现M2-TAMs 能够上调Ki67 水平，促进H292 细胞和裸鼠移植瘤的生长［17］。人参皂苷Rh2能够降低TAMs向M2型极化，抑制MMP-2/9的表达，从而抑制肺癌细胞的迁移和侵袭［18］。本研究发现与普通TAMs 相比，M2-TAMs 处理的A549 和H1299细胞1 d、2 d、3 d的OD值、划痕愈合率及细胞侵袭数增加，Ki67、MMP-2/9 水平升高；而过表达miR-373 能够减弱M2-TAMs 对癌细胞的部分影响。说明miR-373能够抑制肺癌细胞的增殖和转移。肿瘤血管生成促进肿瘤转移，本研究分析miR-373 对血管密度和成熟度的影响，发现过表达miR-373 能够抑制肺癌组织CD31 和VEGFA 蛋白表达。说明miR-373能够抑制肺癌血管生成。

TAMs 向M2 型极化受多种信号通路调控。JAK3激活后，磷酸化的STAT6进入细胞核从而调控基因的表达［19］。研究发现IL-4 通过激活JAK3/STAT6 信号通路将TAMs 活化为M2-TAMs，同时提高Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1 等特征性基因的表达［20］。阻断JAK3/STAT6 信号通路能够抑制TAMs 向M2 型极化，从而抑制肺癌的转移［21］。本研究中miR-373靶向调控JAK3，过表达miR-373 能够降低JAK3、STAT6 mRNA 及p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6 蛋白水平；降低M2-TAMs 特征 性 基因CD206、IL-10、Mrc1、Arg1、Ym1、Fizz1、CCL2水平。说明miR-373通过抑制JAK3/STAT6信号通路抑制TAMs向M2极化。

综上所述，miR-373 通过抑制JAK3/STAT6 信号通路抑制TAMs 向M2 极化，从而抑制肺癌细胞增殖、侵袭转移和血管生成。