UHPLC结合化学计量学分析不同采收期茶枝柑青皮中黄酮类成分

张戴英，何小芳，黄健晶，张英，吴孟华，曹晖，马志国*（1.广东大翔中药制药有限公司，广州 51085；2.张戴英女职工创新工作室，广州 51085；.暨南大学岭南传统中药研究中心，广州 511400）

青皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮，具有疏肝破气、消积化滞的功效[1]。青皮中含有挥发油、黄酮类化合物、氨基酸、胺类、生物碱、有机酸等成分，其中以橙皮苷为代表的黄酮类成分是青皮的主要活性成分[2-3]，多采用HPLC法进行分析[4-7]。文献报道，采收期不同的个青皮与四花青皮中黄酮类成分、挥发油含量及组成均存在较大差异[8-12]。茶枝柑（Citrusreticulata‘Chachi’）是橘的众多栽培品种之一，主产于广东新会，为广东道地药材广陈皮的基原植物，5月落果晒干为个青皮，俗称“柑胎仔”；7～9月份采收未成熟的果实后将果皮纵向剖成4瓣，去除果籽果肉，晒干后即得四花青皮[13]，俗称“柑青皮”，文献报道橙皮苷在“柑胎仔”中的含量明显高于“柑青皮”[14]，而其他成分与采收时间的相关性未见报道。本研究采用UHPLC-DAD指纹图谱结合多指标定量方法，对不同采收期茶枝柑青皮的指纹图谱和8个黄酮类成分含量进行对比，为不同采收期茶枝柑青皮中黄酮类成分变化趋势和质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色谱仪（DAD检测器）；XSR105/A十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多），FA 2204B 万分之一电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-98-Ⅱ单列两孔恒温水浴锅（TAISITE仪器有限公司）；YF-高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精其仪器有限公司）。

1.2 试药

芸香柚皮苷（批号：Y-071-190329）、橙皮苷（批号：C-006-191012）、香蜂草苷（批号：X-034-181216）、甜橙黄酮（批号：T-046-190328）、川陈皮素（批号：C-015-180306）、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮（批号：Q-113-191016）、桔皮素（批号：J-022-180730）（成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于98.0%）；5-去甲川陈皮素（批号：wkq19021312，四川维客奇生物科技有限公司，纯度大于98.0%）。乙腈（上海麦克林生化科技有限公司）、甲酸（天津科密欧化学试剂有限公司）、甲醇（上海晶纯实业有限公司）均为色谱纯，水为纯净水[华润怡宝饮料（中国）有限公司]，其余试剂均为分析纯。

本研究收集了5月产的茶枝柑干燥幼果11批，晒干，为个青皮；7～9月采摘茶枝柑未成熟鲜果38批，加工为干燥的果皮，为四花青皮。详见表1。

表1 样品信息表Tab 1 Sample information

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取青皮样品粉末0.2 g（过5号筛），精密称定，置150 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理（700 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黄酮、川陈皮素、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮、桔皮素和5-去甲川陈皮素对照品粉末适量，加入甲醇配成质量浓度分别为149、334、61.6、15.4、62、16、60.8、15.7 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为乙腈（B）-0.1%甲酸水（A），梯度洗脱（0～8 min：15%→45%B，8～12 min：45%→65%B，12～15 min：65%→15%B），检测波长为283 nm或330 nm，流速为0.3 mL·min-1，柱温为35℃，进样量为2 μL。

2.4 UHPLC指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验 取同一批样品（QP-0501）粉末（过5号筛），按“2.1”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以2号峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.10%，相对峰面积的RSD均小于0.20%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批样品（QP-0501）粉末（过5号筛），按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12 h进样测定，以2号峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.10%，相对峰面积RSD均小于0.70%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 分别取同一批样品（QP-0501）粉末（过5号筛）各6份，精密称定，按“2.1”项下方法分别制备，进样测定，以2号峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.20%，相对峰面积RSD均小于2.3%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 指纹图谱的建立 取所有批次的样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。利用Agilent Chem Station 软件将色谱数据导出为“AIA”格式，并将5、7、8、9月份的青皮样品所得的数据分别导入《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012）相似度软件，生成各自的指纹图谱及共有模式图谱（见图1、2）。

图2 不同采收期青皮的共有模式图Fig 2 Specific chromatograms of Canarh Fructus at different harvesting periods

2.4.5 共有峰的指认 取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定。通过保留时间结合紫外光谱图对指纹图谱中的8个共有峰进行了指认，分别为芸香柚皮苷（1号峰）、橙皮苷（2号峰）、香蜂草苷（3号峰）、甜橙黄酮（4号峰）、川陈皮素（5号峰）、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮（6号峰）、桔皮素（7号峰）、5-去甲川陈皮素（8号峰）。

从图1、2可以看出，5月采收的青皮图谱与另外3个月采收的青皮图谱有明显差异，而7～9月间的青皮图谱变化不明显；随着生长期的增加，2号峰（橙皮苷）的相对峰高明显降低，A区域的共有峰随着月份的增加变化不明显，需进一步通过含量测定进行分析比较。

2.4.6 相似度分析 将以上得到的数据导入《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012）相似度软件，计算各自的相似度，结果见表2。

表2 不同采收期青皮样品相似度评价Tab 2 Similarity evaluation of Canarh Fructus at different harvesting periods

从表2可知，49批4个不同采收期（5、7、8、9月份）青皮的指纹图谱相似度分别是0.996～1.000、0.972～1.000、0.985～1.000、0.984～1.000。相同采收期的青皮相似度均＞0.97，说明相同月份采摘的青皮之间质量稳定性较好。通过对比4个不同采摘月份的青皮的共有模式图的相似度（见表3），发现7～9月采收的四花青皮相似度极高，而5月份采收的个青皮与四花青皮相似度＜0.78，相似度较低，表明不同成熟度的青皮质量存在一定的差异。

表3 共有模式的相似度比较Tab 3 Similarity of shared patterns

2.5 青皮中8种黄酮类成分的含量测定

参考本课题组已建立的UHPLC法[15]，对不同采收期茶枝柑青皮的样品中的8个黄酮类成分进行定量分析。

2.5.1 含量测定 分别精密吸取“2.1”及“2.2”项下供试品溶液和对照品溶液2 μL，按“2.3”项下方法测定，用外标法计算含量，结果见表4、5。

表4 不同采收期青皮样品8个成分含量测定结果(%)Tab 4 Content of 8 components of Canarh Fructus at different harvesting periods (%)

由表5可知，不同采收期的青皮样品中各测定成分有不同程度的差异，采用单因素方差分析，对不同月份的8种成分含量进行差异比较。结果表明，芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷和5-去甲川陈皮素的5月份的含量显著高于7～9月份（P＜0.001）。甜橙黄酮5月份的含量明显低于7～9月份（P＜0.001）。川陈皮素5月份的含量明显低于7月份和8月份（P＜0.001），而9月份的川陈皮素含量低于8月份（P＜0.05）。3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮5月份的含量明显低于7～9月份（P＜0.001），而且7月份的3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮含量显著低于8月份（P＜0.01）。桔皮素在5月、7月、8月和9月的含量没有显著差异。

表5 不同采收期青皮中8个成分的含量平均值(%)Tab 5 Average content of 8 components of Canarh Fructus at different harvesting periods (%)

2.5.2 聚类分析 为比较不同采收时间青皮之间成分的差异，以各样品中黄酮类成分含量测定结果为变量，将数据导入ImageGP进行热图聚类分析（见图3）。由聚类分析结果可得，5月份采收的青皮可聚为一类，7、8、9月份的青皮聚为另一类，从热图可以看出5月份采收的个青皮中芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷含量均高于其他月份采收的四花青皮，提示随着采收时间的后推，黄酮苷类成分有降低的趋势。

2.5.3 主成分分析 采用SIMCA 14.1软件，以测得的8个黄酮类成分含量测得结果为变量，建立主成分分析模型，绘制主成分分析得分图（见图4）。结果可知，前2个主成分累积贡献率为93.5%，其中第1主成分贡献率为 68.8%，第2主成分贡献率为24.7%。从所得的方差贡献率来看，建立的模型累积解释能力参数R2X和预测能力参数Q2分别为0.935 和 0.855，说明模型的区分度和预测程度都较好，前2个主成分已基本能反映出不同月份青皮样品的主要特征。5月份采收的个青皮与7、8、9月份采收的四花青皮能显著区分开来，个青皮与四花青皮在成分含量上存在明显的差异；而7～9月采收的样品并不能显著分开，说明这3个月份采收的青皮黄酮类含量差异不明显。主成分分析结果与热图聚类分析结果一致，提示青皮含有的黄酮类成分与采收时间具有一定的相关性。

图4 不同月份青皮主成分分析图Fig 4 Principal component analysis for different months

3 讨论

3.1 不同采收期青皮的指纹图谱

本研究建立了青皮药材中黄酮类成分的UHPLC-DAD指纹图谱，共标定了8个共有峰，分别为芸香柚皮苷（1号峰）、橙皮苷（2号峰）、香蜂草苷（3号峰）、甜橙黄酮（4号峰）、川陈皮素（5号峰）、3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮（6号峰）、桔皮素（7号峰）和5-去甲川陈皮素（8号峰）。采用UHPLC指纹图谱法对不同采收期的青皮进行相似度分析，发现相同月份采收的青皮样品的指纹图谱相似度均＞0.9，说明相同采收期的青皮样品之间均一性相对较高、质量相对较稳定。5月份与其他月份的共有模式图相似度均＜0.8，而7～9月采收的青皮的相似度极高。聚类分析与主成分分析均可将5月采收的样品与7～9月采收的样品分开，说明采收期是影响青皮质量的关键因素，7～9月份采收的青皮质量较稳定。

3.2 不同采收期青皮的黄酮类成分含量

不同采收期青皮中8种黄酮类成分含量测定结果表明，7～9月的青皮中甜橙黄酮和3'，4'，3，5，6，7，8-七甲氧基黄酮的含量明显高于5月；川陈皮素和桔皮素的含量随着月份的增加变化不明显；随着生长期的增加，芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、5-去甲川陈皮素4种黄酮类成分显著减少，其中以未成熟幼果入药的个青皮（柑胎仔）含量最高，说明青皮中黄酮类成分的含量与生长期密切相关。