台湾香檬果皮川陈皮素分离制备及其抗肿瘤活性研究
2021-07-20刘韶松何丽娟沈瑞池黄珺梅
谷 乐,刘韶松,何丽娟,沈瑞池,黄珺梅
(1.福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点实验室,福建 厦门 361006;2.厦门华侨亚热带植物引种园/厦门市植物引种检疫与植物源产物重点实验室,福建 厦门 361002)
台湾香檬(Citrus depressa),又名扁实柠檬,属芸香科柑橘属多年生植物[1],台湾四种原生柑橘之一。台湾香檬香味特殊,病虫害少,易于栽培管理,果皮中富含川陈皮素,是我国台湾地区以及日本非常受欢迎的健康养生作物[2—3]。
川陈皮素(Nobiletin,NOB)又称蜜橘黄酮、川皮亭等,是从柑桔属植物果皮中提取的多甲氧基黄酮类化合物[4]。川陈皮素能对人体起抗氧化、抗癌、抗炎等作用,还具备神经营养活性,可治疗阿尔茨海默症等神经衰退性疾病[5—8]。此外,川陈皮素对于肥胖症、高血脂、神经变性等疾病也有一定的疗效,并能有效防止皮肤色素沉着、抗黑色素瘤等[9—10]。川陈皮素在医学和食品中都有较高的应用价值,但较高的市场价格限制其广泛应用。川陈皮素主要从柑橘、茶枝柑等果皮中提取分离制备,也可用桔皮素等黄酮物质为母本化学合成,但受制于原材料含量、成本等尚无法大量获得,限制了川陈皮素的进一步药用和食用研究[11]。因此,本研究在台湾香檬引种驯化成功的基础上,以其果皮为原料分离制备川陈皮素,同时通过MTT和流式细胞仪对川陈皮素的抗肿瘤活性进行初步分析,旨在为台湾香檬的综合开发利用提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
台湾香檬采自厦门市福建省亚热带植物研究所,2015年7月自台湾屏东地区引种[12];川陈皮素对照品,阿拉丁;MTT,上海生工;Annexin V双染试剂盒,Roche;石油醚、甲醇等有机溶剂,国产分析纯试剂;硅胶,青岛鼎康;高效液相色谱仪,Waters 2695;倒置显微镜,Olympus;细胞培养箱,博迅;酶标仪,Thermo;流式细胞仪,Beckman。
1.2 方法
1.2.1 色谱检测条件
色谱柱:Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm),检测波长328 nm,流动相甲醇:水=60:40,流速1 mL·min-1,保留时间 15.50 min。
1.2.2 川陈皮素提取
香檬果皮粉末用 10倍体积的 90%甲醇超声提取10 min。提取三次,提取液减压浓缩得到浸膏。
1.2.3 川陈皮素分离
硅胶柱分离:取香檬皮浸膏30 g,甲醇溶解后与90 g硅胶拌样,装填于减压层析柱上(400 mm ×90 mm,柱高130 mm,硅胶重300 g),以不同比例石油醚-乙酸乙酯(10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、0:1)梯度洗脱。
高效制备液相分离:色谱柱SB-C18 PrepHT,5 μm,30 mm×150 mm;流动相甲醇:水=60:40;流速20 mL·min-1;波长 328 nm。
1.2.4 川陈皮素抗肿瘤实验
1.2.4.1 MTT比色法
选择生长状态较好的肝癌HepG2、肺癌A549、宫颈癌 Hela细胞,对其进行消化并得到细胞悬液,利用血球计数板计数。按照每孔100 μL将4000个细胞接种于96孔板中,每隔24 h每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL。在37 ℃细胞培养箱中反应4 h,每孔加 100 μL 10% SDS-0.01 mol·L-1HCL 溶解过夜,离心后上清液在波长560 nm测定吸光值。
1.2.4.2 流式细胞测定法
选取不同浓度川陈皮素(40、80 μmol·L-1)研究对肝癌细胞 HepG2凋亡的影响。将 HepG2细胞以8×105个接种于60 mm培养皿中,培养过夜,离心弃上清,加入1 mL 磷酸缓冲液重悬细胞,再将细胞放在涡旋仪上逐滴加入3 mL预冷的95%乙醇,放入 4 ℃过夜。再次离心弃上清,用 400 μL PBS重悬细胞,加入 4 μL RNase(10 mg·mL-1),避光 37 ℃作用 30 min,最后加入 20 μL PI(1 mg·mL-1)并于 37 ℃作用30 min,上流式细胞仪分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
根据测定数据得到回归方程y=8.4549x-1.3342,R²=0.9999,表明在实验进样范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.2 川陈皮素的分离
硅胶柱分离:取不同比例的石油醚-乙酸乙酯(10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、0:1)的洗脱液进行液相检测,确定川陈皮素几乎全部集中于石油醚:乙酸乙酯(2:1)洗脱液中。收集此部分洗脱剂,浓缩后用制备液相进一步纯化。
高效制备液相分离:收集28 min的馏分,浓缩后减压干燥,获得川陈皮素高纯品(图1)。
图1 分离所得川陈皮素液相色谱检测图Fig.1 Liquid chromatographic analysis of nobiletin
2.3 台湾香檬川陈皮素的结构
川陈皮素纯品为黄色粉末,1H-NMR(MeOD,400 MHz)δ:7.63(1H,dd,J=8.4/1.6 Hz,H-6'),7.52(1H,J=1.6Hz,H-2'),7.01(1H,dd,J=8.4 Hz,H-5'),6.84 (1H,s,H-3),4.01、3.96、3.86、3.833、3.825、3.77(each 3H,s,OCH3),3.83,3.82(6H,s,OCH3),13C-NMR(MeOD,400 MHz) δ:160.7(C-2),106.7(C-3),176.2(C-4),147.8(C-5),143.9(C-6),151.4(C-7),138.1(C-8),147.6(C-9),114.7(C-10),123.6(C-1'),109.2(C-2'),149.6(C-3'),152.0(C-4'),112.3(C-5'),119.7(C-6'),(62.3,62.2,61.9,61.8,56.1,56.1)6个OCH3。以上数据与董发武等[13]的报道一致,确定化合物为川陈皮素(图 2)。
图2 川陈皮素结构式Fig.2 The structural formula of nobiletin in Citrus depressa peel
2.4 台湾香檬川陈皮素抗肿瘤活性
选取肝癌HepG2、肺癌A549、宫颈癌Hela细胞,分别设置 0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1和 40 μmol·L-1等比浓度梯度,利用 MTT方法分析川陈皮素对三种肿瘤细胞增殖能力的影响。实验表明川陈皮素对肿瘤细胞具有一定的广谱抑制作用,并呈现出浓度依赖性(图3)。
图3 不同浓度川陈皮素对3种癌细胞增殖的影响Fig.3 The effect of different concentrations of nobiletin on proliferation of 3 carcinomas cells
取 40 μmol·L-1、80 μmol·L-1川陈皮素研究其对肝癌细胞HepG2凋亡的影响。结果显示,川陈皮素能够促进肝癌细胞的凋亡进程,40 μmol·L-1浓度作用肝癌细胞时早期凋亡率由 1.0%上升至 3.5%,晚期凋亡则从1.8%升高到13.6%;川陈皮素浓度增高至80 μmol·L-1时,其早期凋亡率为3.7%,晚期凋亡率为20.7%(图4)。以上数据表明,川陈皮素能影响肝癌细胞凋亡进程,促进肝癌细胞凋亡。
图4 不同浓度川陈皮素对肝癌细胞HepG2凋亡的影响Fig.4 The effect of different concentrations of nobiletin on apoptosis of liver cancer cells
3 讨论
本文通过超声波方法从台湾香檬果皮中提取川陈皮素,最终分离制备得到含量为98%的高纯川陈皮素样品。用高效液相色谱进行纯度分析,并经高效液相色谱和质谱联用对其结构进行确证。天然产物尤其是植物来源的生物活性化合物因具有更高的生物反应性和靶点协同进化性,对正常细胞毒性较小,已在癌症化疗中获得越来越多的关注。目前已证实在结肠癌[14]、前列腺癌[15]、甲状腺癌[16]、膀胱癌[17]、肾癌[18]、鼻咽癌[19]和口腔鳞状细胞癌[20]等组织中均有明显的抑癌作用。近年来台湾香檬活性成分川陈皮素被用于抗肿瘤、抗炎等方面。本研究选取肝癌、肺癌和宫颈癌细胞作为细胞模型,通过体外活性实验发现台湾香檬川陈皮素可显著抑制肿瘤细胞增殖,川陈皮素可以诱导肝癌细胞凋亡。说明台湾香檬化学活性成分川陈皮素在调控肿瘤发生与发展中扮演着重要角色,而肿瘤细胞生长往往是不可控的,细胞增殖与凋亡机制紊乱是造成肿瘤无限生长的关键因素。川陈皮素作为台湾香檬的天然活性物质,因其低毒性而成为有前景的药物制剂。本研究表明,川陈皮素对肿瘤具抑制作用,为川陈皮素作为天然植物产物活性药物提供理论依据。