赤雹根化学成分的研究

毛晓霞，聂 佳，佟继铭，马 帅，刘永平，郝 婷

（承德医学院，河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000）

赤雹为葫芦科赤雹属植物，以果实或块根入药，块根在民间主要用来治疗腰腿疼痛、软组织挫伤、痛经、乳汁不下等症［1］。总皂苷是赤雹根的主要活性成分，具有抗炎、镇痛、降血糖、抗类风湿性关节炎等作用［2-3］。为了进一步阐明赤雹根总皂苷的化学组成，寻找天然活性皂苷类化合物，本研究采用硅胶、ODS、制备HPLC 等方法对赤雹根总皂苷开展了分离纯化、结构鉴定、活性评价等，首次从赤雹根中分离得到的5 个齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，其中3 个化合物为新化合物，结构见图1。

图1 化合物1～3 结构Fig.1 Structures of compounds 1-3

1 材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； AVANCE Ⅲ400 NMR 波谱仪（德国Bruker公司）； IRAffinity-1 红外光谱仪、LC-10AS 半制备色谱仪（日本岛津公司）； Waters XBridgeTMPrep C18、Discovery C18、ultimate HILI Amide 色谱柱（美国Waters 公司）； 层析硅胶、硅胶板（青岛海洋化工厂）； ODS RP-18 硅胶、硅胶60 F254薄层色谱板（德国Merck 公司）。L-半胱氨酸甲酯盐酸盐、邻甲苯异硫氰酸酯（上海麦克林生化科技股份有限公司）；D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸对照品（中国食品药品检定研究院）。乙腈、甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）； 其他试剂均为分析纯； 水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

赤雹根于2016 年10 月采自河北省青龙县，经承德医学院赵春颖研究员鉴定为葫芦科植物赤雹ThladianthadubiaBunge 的干燥块根，标本（编号20161006） 保存于承德医学院中药研究所。

2 方法

2.1 提取与分离 将13 kg 赤雹根粉碎，45%乙醇加热回流提取3 次，每次1 h，回收乙醇浓缩至1.15 g/mL，加入95%乙醇至体积分数为80%，静置24 h，滤过，回收乙醇，得粗浸膏1.2 kg，用水稀释，过HPD-100 型大孔树脂柱，依次用水、30%乙醇、75%乙醇梯度洗脱，收集75%乙醇洗脱液，回收乙醇至无醇味，用水饱和的正丁醇萃取，得相应萃取物，即为总皂苷。

总皂苷（120 g） 经硅胶柱分离，以三氯甲烷-甲醇-水（18 ∶7 ∶1、14 ∶7 ∶1） 梯度洗脱，TLC检识合并，得Fr.A ～Fr.H。Fr.B （32 g） 经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-甲醇-0.1%甲酸（26 ∶2 ∶1）洗脱，TLC 检识合并，得Fr.B1 ～Fr.B6，Fr.B2（4.6 g） 经ODS 柱分离，以30% ～90%甲醇梯度洗脱，合并相似组分，得Fr.B2-1～Fr.B2-5，Fr.B2-5（3 g） 经制备HPLC 纯化，以乙腈-0.1% 甲酸（40 ∶60） 洗脱，得化合物1 （67 mg）、2 （52 mg）、4 （18 mg）； Fr.B6 （4 g） 经ODS 柱分离，以30% ～70% 甲醇梯度洗脱，合并相似组分，得Fr.B6-1～Fr.B6-7，Fr.B6-3 （0.8 g） 经制备HPLC纯化，以甲醇-0.1%甲酸（62 ∶38） 洗脱，得化合物3 （30 mg）。Fr.H （5 g） 经ODS 柱分离，以30% ～70% 甲醇梯度洗脱，合并相似组分，得Fr.H1～Fr.H6，Fr.H6 经重结晶，得化合物6 （14 mg）； Fr.H5 （1.5 g） 经制备HPLC 纯化，以乙腈-0.1%甲酸（32 ∶68） 洗脱，得化合物5 （30 mg）。

2.2 糖种类及其绝对构型确定

2.2.1 糖种类 取各化合物3 mg，溶于2 mL 2 mol/L HCl 溶液中，密封，90 ℃加热3 h，反应液冷却后加3 mL 水，乙酸乙酯萃取3 次，每次5 mL，萃取后水层减压浓缩，甲醇溶解，滤过，得单糖部分，与标准糖对照品进行HPLC 分析。色谱条件为Ultimate HILI Amide 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.2% 甲酸（80 ∶20）； 柱温35 ℃； ELSD 检测器温度80 ℃； 氮气体积流量2.5 mL/min （葡萄糖12.53 min，半乳糖13.25 min，葡萄糖醛酸10.34 min）。

2.2.2 糖绝对构型 单糖部分与标准糖对照品分别溶于1 mL 0.2%L-半胱氨酸甲酯盐酸盐吡啶溶液中，60 ℃加热1 h，加入1.8 μL 邻甲苯异硫氰酸酯，60 ℃加热1 h，对反应混合物进行HPLC 分析。参考文献［4］ 报道，色谱条件为Discovery C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-水（24 ∶76）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长250 nm； 进样量10 μL （保留时间分别为D-葡萄糖醛酸42.55 min，D-半乳糖11.05 min，D-葡萄糖12.47 min）。见图2。

图2 化合物1～4 糖衍生化后的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of compound 1-4 after sugar derivatization

3 结构鉴定

化合物1： 白色无定形粉末，易溶于吡啶、DMSO、甲醇等有机溶剂，熔点261 ～263 ℃。Liebermann-Burchard 反应、Molish 反应均呈阳性，提示为皂苷类化合物，酸水解、衍生化HPLC 检出D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸。HR-TOF-MS 显示准分子离子峰m/z： 851.445 4 ［M-H］-（理论值851.442 8），推测分子式C44H68O16，相对分子量852。UV 光谱显示最大吸收峰为194 nm，IR 光谱显示含有羟基 （3 418 cm-1）、C ＝O 键 （1 723 cm-1）、C ＝C 键（1 635 cm-1）。1H-NMR （C5D5N，400 MHz） 显示6 个甲基质子信号δ： 1.40 （3H，s），0.82 （3H，s），0.98 （3H，s），1.94 （3H，s），1.08 （3H，s），1.19 （3H，s），1 个环内烯氢信号δ： 5.62 （1H，brs，H-12），1 个醛基氢信号δ： 9.93 （1H，s，H-23）；13C-NMR （C5D5N，100 MHZ） 谱可见2 个烯碳信号δ： 122.5 （C-12），145.7 （C-13），1 个醛基碳信号δ： 209.8 （C-23），1 个羧基碳信号δ： 180.4 （C-28），6 个甲基信号δ： 11.3，16.2，17.9，27.7，33.8，25.3。以上特征信号提示，化合物1 苷元为皂树皮酸［5-6］。

除了苷元信号外，1H-NMR 谱可见2 个糖端基质子信号δ： 4.93 （1H，d，J＝7.5 Hz），5.26（1H，d，J＝7.5 Hz），13C-NMR 谱也显示相应端基碳信号δ： 103.8，106.8，而糖端基氢信号δ：4.93 （1H，d，J＝7.5 Hz） 结合其碳信号δ：103.8、羧基碳信号δ： 170.3，进一步证实葡萄糖醛酸基的存在。

通过HSQC 结合1H-1H COSY、HMBC、TOCSY谱（图3） 将化合物1 的碳氢相关信号进行归属，得到2 个糖基的自旋偶合体系、碳氢信号。糖的连接位置、顺序通过HMBC 谱加以确定，δ： 84.0（C-3） 与δ： 4.93 （GlcA-H-1） 相关，证明糖基GlcA 连接在苷元的C-3 位上；δ： 5.26 （Gal-H-1）与δ： 82.8 （GlcA-C-2） 存在相关峰，证明化合物1 的C-3 位糖链为Gal- （1→2） -GlcA，再结合糖端基偶合常数，确定两者构型均为β 型。1H-NMR中δ： 4.26 （2H，m），1.17 （3H，t，J＝7.0 Hz）提示结构中存在乙氧基，再结合HMBC 谱中δ：4.26 （乙基中的-CH2） 与δ： 170.3 （GlcA-C-6）存在相关峰，证明化合物1 结构中存在6-O-乙基-葡萄糖醛酸基。基于以上数据，确定化合物1 结构为皂树皮酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖- （1→2） -6-O-乙基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，经Scifinder 系统检索确定为新化合物，结构见图1，1H-NMR、13C-NMR数据见表1～2。

表1 化合物1～3 苷元的1H-NMR、13C-NMR 数据Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compounds 1-3 aglycones

图3 化合物1～3 的关键1H-1HCOSY （-） 和HMBC （H→C） 相关Fig.3 Key 1H-1HCOSY （-） and HMBC （H→C） correlations of compounds 1-3

化合物2： 白色无定形粉末，易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂，熔点258 ～259 ℃。Liebermann-Burchard、Molish 反应均呈阳性，提示为皂苷类化合物，酸水解、衍生化HPLC 检出D-葡萄糖。HRTOF-MS 显示准分子离子峰m/z： 809.435 9 ［MH］-（理论值809.432 3），推测分子式C42H66O15，相对分子量810。UV 光谱显示最大吸收峰为190 nm，IR 光谱显示含有羟基（3 405 cm-1）、C ＝O 键（1 715 cm-1）、C ＝C 键 （1 635 cm-1）。1H-NMR（C5D5N，400 MHz） 显示6 个甲基质子信号δ：1.32 （3H，s），0.84 （3H，s），0.99 （3H，s），1.85 （3H，s），1.08 （3H，s），1.19 （3H，s），1 个环内烯氢质子信号δ： 5.65 （1H，brs），1 个醛基氢质子信号δ： 9.73 （1H，s，H-23）。13CNMR （C5D5N，100 MHz） 谱可见2 个烯碳信号δ：122.5 （C-12），145.7 （C-13），1 个醛基碳信号δ： 207.2 （C-23），1 个羧基碳信号δ： 180.4 （C-28），6 个甲基信号δ： 10.8，16.2，17.9，27.7，33.8，25.3。以上特征信号提示，化合物1 苷元为皂树皮酸。

除了苷元信号外，1H-NMR 显示两端基质子信号δ： 4.82 （1H，d，J＝7.7 Hz），5.28 （1H，d，J＝7.7 Hz），13C-NMR 谱也显示相应端基碳信号δ：104.7，106.4。通过 HSQC 结合1H-1H COSY、HMBC、TOCSY 谱（图3） 将化合物2 的碳氢相关信号进行归属，得到2 个糖基的自旋偶合体系和碳氢信号。糖的连接位置和顺序通过HMBC 谱加以确定，δ： 4.82 （Glc1-H-1） 与δ： 82.1 （C-3） 存在相关峰，证明糖基Glc1连接在苷元的C-3 位上；δ： 5.28 （Glc2-H-1） 与δ： 89.2 （Glc1-C-3） 存在相关峰，证明C-3 糖链为Glc2- （1→3） -Glc1，再结合糖端基偶合常数确定两者构型均为β 型。基于以上数据，最终鉴定化合物2 结构为皂树皮酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖- （1 →3） -β-D-吡喃葡萄糖苷。经Scifinder 系统检索，化合物2 为新化合物，结构见图1，1H-NMR、13C-NMR 数据见表1～2。

化合物3： 白色无定形粉末，易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂，熔点258 ～260 ℃。Liebermann-Burchard、Molish 反应均呈阳性，提示为皂苷类化合物，酸水解、衍生化HPLC 检出D-葡萄糖、D-半乳糖。FT-ESI-MS 显示准分子离子峰m/z：995.484 8 ［M＋Na］＋（理论值995.482 7），推测分子式C48H76O20，相对分子量972。UV 光谱显示最大吸收峰为192 nm。IR 光谱显示含有羟基（3 390 cm-1）、C ＝O 键（1 716 cm-1）、C ＝C 键（1 634 cm-1）。1H-NMR （C5D5N，400 MHZ） 显示6 个甲基质子信号δ： 1.44 （3H，s），0.80 （3H，s），0.96 （3H，s），1.79 （3H，s），1.06 （3H，s），1.17 （3H，s），1 个环内烯氢质子信号δ： 5.61（1H，brs，H-12），1 个醛基质子信号δ： 9.91（1H，s，23-CHO）。13C-NMR （C5D5N，100 MHz）谱可见2 个烯碳信号δ： 122.5 （C-12），145.7（C-13），1 个醛基碳信号δ： 210.5 （C-23），1 个羧基碳信号δ： 180.4 （C-28），6 个甲基信号δ：11.4，16.2，17.9，27.6，33.8，25.5。以上特征信号提示，化合物3 苷元为皂树皮酸。

除了苷元信号外，1H-NMR 谱中可见3 个糖端基质子信号δ： 4.73 （1H，d，J＝7.5 Hz），5.28（1H，d，J＝7.7 Hz），5.54 （1H，d，J＝7.8 Hz），13C-NMR 谱也显示相应端基碳信号δ： 103.8，105.2，104.8。通过 HSQC 结合1H-1H COSY、HMBC、TOCSY 谱（图3） 将化合物3 的碳氢相关信号进行归属，得到3 个糖基的碳氢信号。糖的连接位置、顺序通过HMBC 谱加以确定，δ： 84.4（C-3） 与δ： 4.73 （Glc1-H-1） 存在相关峰，证明糖基Glc1连接在苷元的C-3 位上；δ： 5.28 （Glc2-H-1） 与δ： 89.3 （Glc1-3），δ： 5.54 （Gal-H-1）与δ： 79.1 （Glc1-2） 相关，证明C-3 糖链为Gal-（1→2） - ［Glc2- （1→3）］ -Glc1，再结合糖端基偶合常数确定3 个糖构型均为β 型。基于以上数据，确定化合物3 结构为皂树皮酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖- （1→2） - ［β-D-吡喃葡萄糖- （1→3）］ -β-D-吡喃葡萄糖苷。经Scifinder 系统检索，化合物3 为新化合物，结构见图1，1H-NMR、13C-NMR 数据见表1～2。

化合物4： 白色粉末，易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂，熔点249 ～251 ℃。Liebermann-Burchard、Molish 反应均呈阳性，提示为皂苷类化合物，酸水解及衍生化HPLC 检出D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸。ESI-MSm/z： 836.9 ［M-H］-，861.0 ［M＋Na］＋，分子式C43H66O16。1H-NMR （C5D5N，400 MHz）δ：1.37 （ 3H，s，24-CH3），0.82 （ 3H，s，25-CH3），0.98 （3H，s，26-CH3），1.94 （3H，s，27-CH3），1.08 （3H，s，29-CH3），1.19 （3H，s，30-CH3），5.62 （1H，brs，H-12），9.93 （1H，s，H-23），3.72 （3H，s，-OCH3），4.90 （1H，d，J＝7.2 Hz，GlcA-H-1），5.22 （1H，d，J＝7.6 Hz，Gal-H-1）；13C-NMR （C5D5N，100 MHz）δ：38.5 （C-1），25.2 （C-2），83.9 （C-3），55.5（C-4），48.8 （C-5），20.8 （C-6），33.2 （C-7），40.6 （C-8），47.7 （C-9），36.8 （C-10），24.2（C-11），122.5 （C-12），145.7 （C-13），42.6（C-14），36.7 （C-15），75.0 （C-16），49.3 （C-17），41.9 （C-18），47.5 （C-19），31.5 （C-20），36.5 （ C-21），33.4 （ C-22），209.8 （ C-23），11.3 （C-24），16.2 （C-25），17.8 （C-26），27.7（C-27），180.4 （C-28），33.8 （C-29），25.3 （C-30），GlcA： 103.8 （C-1），82.8 （C-2），77.9（C-3），73.0 （C-4），77.2 （C-5），170.8 （C-6），52.6 （-OCH3），Gal： 106.8 （C-1），75.1 （C-2），75.5 （C-3），70.6 （C-4），77.7 （C-5），62.6（C-6）。以上数据与文献［7］ 报道基本一致，故鉴定为皂树皮酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖- （1→2） -6-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。

化合物5： 白色粉末，易溶于吡啶、DMSO、水，可溶于甲醇。Liebermann-Burchard、Molish 反应均呈阳性，提示为皂苷类化合物。FT-ESI-MSm/z： 1 351.620 0 ［M＋H］＋（计算值1 351.616 8），分子式C63H98O31。1H-NMR （DMSO-d6，400 MHz）δ： 1.06 （3H，s，24-CH3），0.88 （3H，s，25-CH3），0.65 （3H，s，26-CH3），1.11 （3H，s，27-CH3），0.88 （3H，s，29-CH3），0.88 （3H，s，30-CH3），1.14 （3H，d，J＝6.0 Hz，Rha-H-6），5.21 （1H，brs，H-12），9.46 （1H，s，23-CHO），4.27 （1H，d，J＝8.0 Hz，GlcA-H-1），4.27 （1H，d，J＝8.0 Hz，Gal-H-1），5.59 （1H，s，Ara-H-1），4.79 （ 1H，s，Rha-H-1），4.48（1H，d，J＝8.0 Hz，Xyl-H-1），4.43 （1H，d，J＝8.0 Hz，Xyl-H-1）；13C-NMR （DMSO-d6，100 MHZ）δ： 37.4 （C-1），24.1 （C-2），82.2 （C-3），53.9 （C-4），47.1 （C-5），19.7 （C-6），31.7 （C-7），41.2 （C-8），46.7 （C-9），35.5（C-10），23.4 （C-11），121.7 （C-12），143.4（C-13），41.2 （C-14），27.2 （C-15），22.9 （C-16），46.1 （C-17），40.7 （C-18），45.3 （C-19），30.4 （ C-20），33.1 （ C-21），31.7 （ C-22），209.2 （ C-23），10.2 （ C-24），15.3 （ C-25），16.6 （ C-26），25.5 （ C-27），175.1 （ C-28），32.7 （C-29），23.4 （C-30），GlcA： 101.6 （C-1），81.1 （C-2），75.8 （C-3），71.2 （C-4），75.1 （C-5），170.6 （C-6），Gal： 104.5 （C-1），72.3 （C-2），72.9 （C-3），67.7 （C-4），74.9（C-5），59.8 （C-6），Ara： 91.5 （C-1），73.7（C-2），70.0 （C-3），67.7 （C-4），64.2 （C-5），Rha： 99.3 （C-1），70.5 （C-2），69.4 （C-3），81.8 （C-4），67.7 （C-5），17.5 （C-6），Xyl1：104.4 （C-1），73.7 （C-2），85.2 （C-3），67.1（C-4），65.5 （C-5），Xyl2： 104.2 （C-1），73.7（C-2），76.1 （C-3），69.4 （C-4），65.7 （C-5）。以上数据与文献［8］ 报道基本一致，故鉴定为3-O-β-D-吡喃半乳糖基（1→2） -β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-丝石竹酸-28-O-β-D-吡喃木糖基（1→3） -β-D-吡喃木糖基（1→4） -α-L-吡喃鼠李糖基（1→2） -α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物6： 黄色针状结晶，熔点202 ～204 ℃。盐酸-镁粉反应呈阳性。ESI-MSm/z： 285.085 5［M＋H］＋（计算值285.076 3），分子式C16H12O5。1HNMR （C5D5N，400 MHz）δ： 7.00 （1H，s，H-6），8.08 （1H，d，J＝6.0 Hz，H-2′），7.62（1H，d，J＝6.4 Hz，H-3′），7.63 （1H，s，H-4′），7.62 （1H，d，J＝6.4 Hz，H-5′），8.08（1H，d，J＝6.0 Hz，H-6′），12.51 （1H，s，5-OH），10.82 （1H，s，7-OH），3.87 （3H，s，8-CH3）；13C-NMR （C5D5N，100 MHz）δ： 163.0 （C-1），105.0 （C-2），182.0 （C-3），156.2 （C-4），99.1 （C-5），157.3 （C-6），127.7 （C-7），149.6（C-8），103.7 （C-9），130.8 （C-10），126.2 （C-1′），129.2 （C-2′），132.0 （C-3′），129.2 （C-4′），126.2 （C-5′），61.0 （8-CH3）。以上数据与文献［9］ 基本一致，故鉴定为汉黄芩素。

4 讨论

本研究主要报道了从赤雹根中首次分离得到的5 个齐墩果烷型三萜皂苷，其中3 个为新化合物。4 个三萜皂苷的苷元为皂树皮酸，皂树皮酸是C-28位为羧基，C-23 位为醛基，C-12 位为双键的齐墩果烷型三萜，其C-3、C-28 位常连有糖链，常见单糖有葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、夫糖、鸡纳糖等。现已报道的同类型皂苷主要分布在葫芦科的木鳖、苦瓜、赤雹，石竹科的九子参、圆锥石头花、Acanthophyllum gypsophiloidesRegel、肥皂草，桔梗科的Adenophora triphyllavar.japonica，罂粟科的荷青花，豆科的QuillajasaponariaMolina［10-11］中。此类皂苷具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、肾保护、免疫佐剂等药理作用，如木鳖子皂树皮酸皂苷通过NF-κB 途径抑制脂多糖诱导的一氧化氮、IL-6 表达，对RAW 264.7 细胞显示出抗炎活性； 皂树皮酸类皂苷对人慢性髓原白血病细胞K562，人肝癌细胞Huh 7［12-13］，人胃癌细胞SNU-1、KATO Ⅲ、AGS，人肺癌细胞A549、H1264、H1299、Calu-6，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人前列腺癌细胞PC-3［14-16］等显示出不同程度的细胞毒性。在皂苷类免疫佐剂研究方面，Idris［17］通过对含有皂树皮酸的皂苷佐剂及其作用机制研究，发现皂树皮酸可能是免疫佐剂活性的战略分子，并且是开发新型佐剂的有力候选者。