基于UPLC指纹图谱的大承气汤单煎液与合煎液对比研究

2023-10-21李素梅陈伟韬毕晓黎胥爱丽肖观林江洁怡张靖年李养学

广东药科大学学报 2023年5期

李素梅，陈伟韬，毕晓黎，胥爱丽，肖观林，江洁怡，张靖年，李养学

[广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095]

大承气汤源自汉代张仲景的《伤寒论》，由大黄、芒硝、厚朴、枳实4味中药组成，为泻下法代表方剂[1-2]，具有峻下热结的作用，主要用于治疗阳明腑实证、热结旁流证、里热实证。大黄有通腑泄热之功为君药，芒硝润燥软坚为臣药，厚朴、枳实行气、消积除胀，二者同为佐药[3]，四药合用，泻下兼行气，共同发挥攻下泻热，行气导滞的作用[4]。大承气汤起初主要用于治疗大便不通，目前临床上主要用于消化系统疾病[5]—肠梗阻、急性胰腺炎、各种腹部手术所致胃肠功能障碍；呼吸系统疾病[5]—急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺心病伴心衰；泌尿系统疾病[5]—慢性肾衰、尿道结石、尿毒症；心脑血管疾病[4]—改善心脑血管患者意识、改善神经功能缺损等；此外还用于有机磷中毒、铅中毒、食物中毒等各种中毒病症的抢救。大承气汤现代应用广泛[3]，涉及内外妇儿等多科疾病。

现代药理研究表明，大承气汤具有泻下、抗菌、抗内毒素、解毒、解热、调节胃肠功能、降低细胞炎因子、调节免疫功能等作用[2]。大黄主要含蒽醌、蒽酮、二苯乙烯、鞣质类等化学成分，其中蒽醌类和蒽酮类是大黄发挥泻下作用的主要活性成分[6-7]。厚朴含有木脂素类、生物碱类、挥发油、黄酮等多种成分，其中厚朴酚与和厚朴酚含量较高，是厚朴的重要质量控制指标[8-9]。枳实含有黄酮、生物碱、挥发油等化学成分，黄酮类为其主要成分，其中以柚皮苷、新橙皮苷含量最高[10-11]。芒硝主要成分为含水硫酸钠[12]。以上成分构成大承气汤发挥药理作用的主要物质基础，也是常用的质量控制指标[13]。

在大承气汤有关化学成分或质量控制研究方面，曾元儿等[14]采用HPLC 法研究了大承气汤中大黄蒽醌类的量变规律，发现传统煎法能有效提高大承气汤主要有效成分的溶存量；陆杰等[15]采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析大承气汤化学成分，鉴定出了73个化合物，主要有蒽醌类、木脂素类、黄酮类等；魏惠珍等[16]建立了大承气汤HPLC 指纹图谱分析方法，共标出12 个共有峰，并标定了其中9 种成分；曹俊岭等[17]采用HPLC 法测定大承气汤传统汤剂与配方颗粒中芦荟大黄素、厚朴酚及和厚朴酚的含量；宁秋菊等[18]采用HPLC 法同时测定了大承气汤中10 种活性成分；大承气汤分煎、合煎化学成分指纹图谱对比研究方面尚未见报道。

中药配方颗粒使用引发的中药单煎与合煎等效性问题，主要表现为化学成分、药效和临床疗效方面，其中化学成分是发挥作用的物质基础，且化学成分的研究可快速发现单煎与合煎的差异，并可探讨存在差异的原因[19]。本研究采用超高效液相色谱技术，建立大承气汤单煎、合煎液UPLC对比指纹图谱，在物质基础层面探讨分煎、合煎存在的差异性，以期为大承气汤配方颗粒的制备工艺及质量标准的提高研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

双杰JJ500 电子天平（江苏常熟）；KQ-700D 超声提取器（江苏昆山）；梅特勒XS205DU 分析天平（瑞士）；安捷伦1290超高效液相色谱仪（美国）。

1.2 试药

没食子酸、儿茶素、橙皮苷、大黄素（质量分数：95.3%）对照品批号分别为0831-9501、877-200001、110721-201316、110756-201512，于中国食品药品检定研究院采购；大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷（质量分数：98%）、大黄酚-8-O-葡萄糖苷（质量分数：95%）、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷（质量分数：98%）对照品批号分别为D-048-181101、D-068-180914、D-052-181213，于成都瑞芬思生物科技有限公司采购；芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷（质量分数：98%）批号为PRF9050721，于成都普瑞法科技开发有限公司采购；大黄素-8-O-葡萄糖苷（质量分数：98%）、大黄酚-1-O-葡萄糖苷（质量分数：98%）、番泻苷A（质量分数：98%）对照品批号分别为AF8121001、AF8122103、AF7081503，于成都埃法生物科技有限公司采购。大黄（产地：甘肃）、芒硝（产地：湖南）、厚朴（产地：四川）、枳实（产地：四川）饮片批号见表1，购于广州金芝中药饮片有限公司，经广东省第二中医院刘法锦教授鉴定。流动相用甲醇为Merck色谱纯试剂，流动相用水是屈臣氏蒸馏水，磷酸、甲醇等为分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 合煎液的制备按大承气汤处方比例称取大黄12.00 g，厚朴15.00 g，枳实12.00 g，芒硝9.00 g，加入10 倍量水，浸泡30 min，加热使之沸腾后，文火慢煎30 min，放冷，滤过，加入500 mL 量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，即得大承气汤合煎液。制备了10批合煎液，分别记为HJS1～S10。

2.1.2 单煎液的制备分别称取大黄12.00 g，厚朴15.00 g，枳实12.00 g，芒硝9.00 g，分别加入10 倍量水，浸泡30 min，加热使之沸腾后，文火慢煎30 min，放冷，滤过，合并各单煎液，加入500 mL 量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，即得大承气汤单煎液。制备了10批单煎液，分别记为DJS1～S10。

2.1.3 供试品溶液的制备精密取煎液5 mL，置具塞锥形瓶中，再精密加入5 mL 甲醇，称重，超声提取10 min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，提取液通过0.22 μm 的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 对照品溶液的制备取没食子酸对照品、儿茶素对照品、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、橙皮苷对照品、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷对照品、番泻苷A 对照品、大黄酚-1-O-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL 含没食子酸28.00 μg、儿茶素20.00 μg、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷19.60 μg、橙皮苷22.87 μg、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷26.26 μg、番泻苷A 40.4 μg、大黄酚-1-O-葡萄糖苷24.30 μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷19.00 μg、大黄素-8-O-葡萄糖苷19.99 μg、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷22.74 μg、大黄素17.60 μg的溶液，即得。

2.2 色谱条件

以Waters ACQUITYHSS T3 柱为色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 µm）；以甲醇流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表2 的规定进行梯度洗脱；检测波长为225 nm，柱温为30 ℃；流速为0.25 mL/min，进样量为2µL。

表2 流动相梯度Table 2 Gradient of mobile phase

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验精密吸取50%甲醇空白溶液及供试品溶液各2 µL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1，结果表明，所建方法能准确测定指纹图谱中所有共有峰，不受空白溶剂干扰。

图1 专属性试验UPLC色谱图Figure 1 UPLC chromatograms of specific test

2.3.2 精密度试验取大承气汤合煎液（S9），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件重复进样6 次测定，每次2 µL，以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷（6 号峰）为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，结果各共有指纹峰相对保留时间的RSD 为0.07%～0.33%，相对峰面积的RSD 为0.94%～2.33%，表明仪器精密度较好。

2.3.3 稳定性试验取大承气汤合煎液（S9），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件分别在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 h进样2µL，测定，以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷（6 号峰）为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD 值，结果各共有指纹峰相对保留时间的RSD 为0.10%～0.46%，相对峰面积的RSD 为1.11%～3.56%，表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验取大承气汤合煎液（S9），按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件分别进样2µL，测定，以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷（6 号峰）为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，结果各共有指纹峰相对保留时间的RSD 为0.09%～0.33%，相对峰面积的RSD为0.58%～2.87%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 参照峰的选择芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷为大黄中主要活性成分之一，在大承气汤指纹图谱中，芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷出峰时间适中，分离度良好，故选择大黄素-8-O-葡萄糖苷为参照峰。

2.4.2 指纹图谱相似度评价及共有峰确定取“2.1.1”“2.1.2”项下制备的合煎液、单煎液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件依次进样测定分析，记录指纹图谱、保留时间和峰面积等信息，将10 批大承气汤合煎、单煎样品的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012 年版，设置合煎1 为参照图谱，用多点校正后进行Mark 峰匹配（时间窗为0.1 min），采用中位数法生成对照指纹图谱，确定了19 个共有峰，20批大承气汤单煎、合煎液共有峰匹配图见图2；运用相似度评价软件进行分析，10 批大承气汤单煎液、合煎液相似度均在0.90 以上，见表3；表明大承气汤单煎液与合煎液共有峰的种类、数目差别不大，化学成分无明显差异。10 批单煎液指纹图谱相对保留时间的RSD为0.07%～0.40%之间，因不同批次饮片含量存在差异，相对峰面积RSD 波动较大，在3.52%～36.95%之间；10 批合煎液指纹图谱相对保留时间的RSD 在0.10%～0.56%之间、相对峰面积RSD在5.22%～46.04%之间。通过与对照品比对，确认1号峰为没食子酸，2号峰为儿茶素，6号峰为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，8 号峰为橙皮苷，9 号峰为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，11号峰为番泻苷A，13号峰为大黄酚-1-O-葡萄糖苷，14号峰为大黄酚-8-O-葡萄糖苷，15 号峰为大黄素-8-O-葡萄糖苷，18 号峰为大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷，19号峰为大黄素，见图3。

图2 大承气汤单煎液、合煎液指纹图谱匹配图Figure 2 Fingerprints of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

图3 大承气汤合煎、单煎液UPLC对照指纹图谱Figure 3 Reference fingerprints of mixed decoction and single decoction of Dachengqi Decoction

表3 20批大承气汤单煎液与合煎液指纹图谱相似度结果Table 3 Results of similarity analysis of 20 batches of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

2.5 化学计量学分析

2.5.1 主成分分析（PCA）为评价大承气汤单煎液与合煎液的差异以及存在差异的化学成分，将20批样品的19个共有指纹峰峰面积标准化后作为变量，使用SPSS18.0 统计软件对20 批次大承气煎液样品进行主成分分析，主成分特征值、累积贡献率见表4，PCA从19个变量中提取了4个特征值大于1的主成分，累积方差贡献率为88.656%，表明前4 个成分可概括大承气汤分煎液、合煎液指纹图谱样品的大部分化学信息。由碎石图（图4）可见，特征值大于1的部分曲线陡峭，小于1的部分趋于平缓，表明提取的4个主成分合理。主成分载荷距阵见表5，推测多种成分会对大承气汤单煎液与合煎液差异性产生影响，色谱峰12、2、14、13、17、6、3、18、4、16、5 在主成分1 中权重较大；主成分2 主要反映了峰15、9、11、19、10的信息；峰8、1在主成分3中贡献值较大。

图4 PCA碎石图Figure 4 The scree plot of PCA

表4 大承气汤单煎液与合煎液主成分分析特征值及累积方差贡献率Table 4 The PCA eigen value and cumulative variance contribution rate of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

表5 大承气汤单煎液与合煎液主成分分析载荷距阵Table 5 Loading matrix of PCA of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

2.5.2 OPLS-DA 为了较好地分析大承气汤单煎液与合煎液之间的差异，将20 批样品19 个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件进行OPLS-DA 分析，由得分图（图5）可见，20 批次样品（大承气汤单煎液与合煎液）显著分为2类。各变量投影重要度（VIP）大小排序见图6，可见各色谱峰影响程度大小依次为峰8＞峰19＞峰4＞峰16＞峰1＞峰17＞峰12＞峰5＞峰15＞峰6＞峰2＞峰14＞峰11＞峰9＞峰18＞峰13＞峰3＞峰7＞峰10，其中峰8（橙皮苷）、峰19（大黄素）、峰4、峰16、峰1（没食子酸）的VIP 值大于1，为区分大承气汤单煎液与合煎液的标志性成分，对分类结果影响显著，提示这几个成分对区分大承气汤单煎液与合煎液贡献较大。

图5 OPLS-DA得分图Figure 5 Score chart of OPLS-DA

图6 VIP图Figure 6 VIP plot

3 讨论

研究过程中，通过PDA 检测器对供试品进行全波长扫描，根据色谱峰的峰数、丰度、基线漂移等情况，确定了检测波长为225 nm；为确保色谱图能总体反映大承气汤的化学信息，实验过程中分别考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等溶剂系统对色谱峰的影响，结果以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，色谱峰信息较为丰富、分离较好且基线平稳；对不同柱温（25、30、35 ℃）、流速（0.2、0.25、0.3 mL/min）、色谱柱进行考察，根据色谱峰分离度、分析时间、柱压等情况确定了最终的分析柱温、流速、色谱柱。供试品溶液的制备考察了含甲醇量（50%、70%）、提取方式（超声、加热回流）、提取时间（10、20、30 min）的提取效果，根据色谱峰峰数，色谱峰总面积大小等确定供试品溶液的制备方法。

本研究建立了大承气汤分煎液与合煎液的UPLC指纹图谱，标识了19个共有峰，并指认出其中没食子酸、儿茶素、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、橙皮苷、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、番泻苷A、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黄素11 个成分。通过中药指纹图谱相似度软件评价，大承气汤单煎液与合煎液相似度均在0.90 以上，另外通过单煎液与合煎液对照指纹图谱比对，色谱峰数未有明显增加或者减少，表明单煎液与合煎液整体化学成分一致性较好。为评价大承气汤单煎液与合煎液差异性，本研究采用PCA 和OPLS-DA 进行分析。PCA 分析出4 种主成分分别反映了19 个共有色谱峰的信息；OPLS-DA分析可将单煎液与合煎液区分成2 类，结合VIP 值＞1，峰8（橙皮苷）、峰19（大黄素）、峰4、峰16、峰1（没食子酸），表明该5 种成分为大承气汤单煎液与合煎液中存在的主要差异性成分。5 种差异性成分中，峰4、峰16、峰19（大黄素）单煎液中煎出量比合煎液高，峰1（没食子酸）、峰8（橙皮苷）合煎液煎出量比单煎液高，提示大承气汤复方中各化学成分间可能会因相互作用产生协同或拮抗效应，进而对化学成分的溶出有一定影响，后续在对大承气汤配方颗粒的制备及质量标准研究方面将重点关注差异性成分，并进一步开展化学成分与药效相关性方面的研究。