姜黄素抑制脊髓组蛋白甲基化在大鼠急性疼痛中的作用

王存斌

（天津市北辰医院麻醉科，天津 300400）

术后急性疼痛（Acute post surgery pain，APSP）主要是患者受到外源性手术刺激后所产生的一系列生理、心理等应激反应。APSP一般发生在术后的24～72 h之内，会增加患者机体疼痛负担，不利于机体的康复[1]。组蛋白是真核生物染色体的基本结构单位，组蛋白包括H1、H2A、H2B、H3、H4五种类型，组蛋白H3K9甲基化是指组蛋白H3第九位赖氨酸残基在组蛋白甲基转移酶的催化下发生了甲基化修饰[2]。研究发现HAT抑制剂ACA可降低小鼠切口痛模型脊髓组蛋白H3K9的表达[3]。神经病理性疼痛大鼠组蛋白H3K9甲基化表达增加[4]，姜黄素对神经系统的生理功能和病理生理过程有诸多影响，可减轻神经炎症反应，抑制慢性疼痛的外周或中枢敏化[5]，还可减轻大鼠的手术后疼痛，促进手术创伤的恢复[6]，但具体机制尚不明确。本研究拟评价姜黄素对大鼠急性切口痛及脊髓组蛋白甲基化的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雄性清洁级Wistar大鼠，体重200～250 g，周龄6～8 w，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（军）-2012-0004。采用随机数字表法将成功鞘内置管的48只健康雄性Wistar大鼠分成4组（n=12）：对照组（D组），疼痛模型组（I组），姜黄素组（C组），二甲基亚砜组（DMSO组）

1.2 方法

1.2.1 鞘内置管[7]

Wistar大鼠经腹腔注射10%戊巴比妥3 mL·kg-1麻醉后，取俯卧位于后正中L5-6间隙作长约3 cm的纵行切口，逐层分离筋膜、肌肉，切断L5-6的棘间韧带，充分暴露L5-6间隙。大鼠脊柱向前弯曲，提起L5椎板，针头刺破黄韧带和硬膜，经破口置入PE0503导管，向上置入2 cm，有脑脊液流出，大鼠出现甩尾反射即为置管成功。导管另一端经皮下隧道引出于头颈部，外露3 cm固定，火烧密封导管头部，避免脑脊液流出。

1.2.2 切口痛大鼠模型[8]

参照Brennan[8]等方法制备切口痛大鼠模型。大鼠在异氟醚麻醉后，取俯卧位，固定大鼠，取其左后足趾部，消毒、铺巾，从后跟0.5 cm处向前做一长约1 cm的纵行切口，动作尽量轻柔保持肌腱及神经不被离断，轻压伤口止血后撒上抗生素，缝合切口。术毕大鼠均采用单笼饲养，注意保温，观察大鼠情况。

1.2.3 分组给药

D组不做任何操作，行为学测试前30 min通过鞘内置管单次注射生理盐水10 μL；I组切口痛建模前30 min通过鞘内置管单次注射生理盐水10 μL ；C组切口痛建模前30 min通过鞘内置管单次注射姜黄素（批号：31027-02-3，Alexis公司，美国）10 μL（50 μg·μL-1）；DMSO组切口痛建模前30 min通过鞘内置管单次注射10%二甲基亚砜（批号：58-59-4，上海免基实业有限公司）10 μL。

1.3 大鼠的机械性痛阈（Mechanical paw withdrawal threshold，MWT）及热痛阈（Thermal paw withdrawal latency，TWL）

分别于建模前24 h（T0），切口痛建模后1 h（T1）、3 h（T2）、6 h（T3）时，测定大鼠的机械性痛阈（MWT）和热痛阈（TWL）。将大鼠放入固定器内，左足趾放置于YSL-3E型电子压痛仪（济南益延科技发展有限公司）的尖形压头下施压，当大鼠出现嘶鸣或挣扎时停止施压，记录压力，测定3次，间隔15 min，取平均值即为MWT。将大鼠放在YSL-6B型智能热板仪（济南益延科技发展有限公司）的玻璃罩内，温度设定为55℃，记录大鼠左足出现舔足或逃避动作的时间，测定3次，间隔15 min，取平均值即为TWL。为避免大鼠烫伤，TWL的测定时间不超过30 s。

1.4 免疫组化法检测甲基化H3K9表达水平

分别于T1、T3时点疼痛行为学测量后，取6只大鼠，在异氟醚麻醉下取出其L4-5节段脊髓，采用免疫组化法检测甲基化H3K9表达水平。脊髓组织放入4%甲醛中固定24 h，常规脱水、透明、包埋，切片，脱蜡，山羊血清封闭，滴加甲基化H3K9抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），4℃孵育24 h；滴加辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物公司），37℃孵育30 min；DAB显色，苏木精复染细胞核，光镜下进行观察，细胞核呈棕黄色为阳性细胞，应用Image-Pro Plus图像分析系统测定光密度值，反映甲基化H3K9表达水平。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般行为学的改变

建模前各组大鼠活动状态良好，建模后各组大鼠状态良好，伤口未裂开、未感染。但I组和DMSO组活动显著减少。

2.2 四组大鼠整体MWT的比较

与D组比较，C组、I组和DMSO组T0时点比较无统计学差异（P＞0.05），T1-3时点MWT降低（P＜0.05）；与I组比较，T1-3时点DMSO组MWT指标无统计学差异（P＞0.05），T1-3时点C组MWT升高（P＜0.05），见表1。

表1 四组大鼠各时点MWT整体比较（±SD，n=12）

表1 四组大鼠各时点MWT整体比较（±SD，n=12）

注：与D组比较，aP＜0.05；与I组比较，bP＜0.05。

MWT(pa)组别 T0 T1 T2 T3 D组 201.8±5.37 203.8±3.36 203.9±3.31 204.3±3.24 I组 203.2±4.17 32.92±1.37 a 31.73±1.71 a 31.93±2.29 a C组 202.5±3.88 52.84±2.90 a b 57.12±2.81 a b 54.30±2.19 a b DMSO组 202.6±6.63 32.38±1.67 a 32.07±1.80 a 32.37±2.71 a

2.3 四组大鼠整体TWL的比较

与D组比较，C组、I组和DMSO组T0时点比较无统计学差异（P＞0.05），T1-3时点TWL缩短（P＜0.05）；与I组比较，T1-3时点DMSO组MWL指标无统计学差异（P＞0.05），T1-3时点C组TWL延长（P＜0.05），见表2。

表2 四组大鼠各时点TWL整体比较（±SD，n=12）

表2 四组大鼠各时点TWL整体比较（±SD，n=12）

注：与D组比较，aP＜0.05；与I组比较，bP＜0.05。

TWL(s)组别 T0 T1 T2 T3 D组 5.42±0.305 5.335±0.204 5.258±0.220 5.248±0.176 I组 5.341±0.243 2.032±0.154 a 2.008±0.099 a 2.067±0.096 a C组 5.276±0.270 3.095±0.133 a b 3.027±0.118 a b 3.142±0.109 a b DMSO组 5.376±0.195 2.064±0.141 a 2.088±0.146 a 2.087±0.125 a

2.4 病理学的变化

各组间比较大鼠脊髓均无炎性细胞的浸润，脊髓细胞未发现水肿、坏死，组织细胞机构与形态正常，见图1。

2.5 组蛋白H3K9甲基化表达的变化

与D组比较，I组、C组和DMSO组T1和T3时点脊髓甲基化H3K9表达上调（P＜0.05）；与I组比较，C组T1和T3时点脊髓甲基化H3K9表达下调（P＜0.05），DMSO组指标无统计学差异（P＞0.05），见表3，图2。

表3 组蛋白H3K9甲基化表达的比较（±SD，n=6）

表3 组蛋白H3K9甲基化表达的比较（±SD，n=6）

注：与D组比较，aP＜0.05；与I组比较，bP＜0.05。

组别 H3K9甲基化表达T1 T3 D组 0.304±0.013 0.303±0.012 I组 0.649±0.025a 0.652±0.024a C组 0.406±0.019ab 0.406±0.014ab DMSO组 0.648±0.024 0.651±0.025

3 讨论

姜黄素是姜科植物姜黄中最重要的有效成分，通过多种作用机制发挥镇痛作用，缓解不同类型的疼痛，改善患者预后[9,10]。关于姜黄素在镇痛方面的研究主要以背根神经节、脊髓背角、相关炎症因子以及酶活性为主[11,12]，研究显示大鼠模型对应的热痛敏以及机械性痛敏明显减轻，这种镇痛作用与对脊髓被根神经节中相关物质的抑制有关，如p-CREB、p-ERK以及c-fos等[13,14]。此外，脊髓背角以及脊髓被根神经节中kBp65受到抑制以及CX3C含量的下降也是神经病理性疼痛减轻的主要机制，这也是姜黄素用于神经病理性疼痛的重要作用机理[15]。研究指出，通过鞘内注射姜黄素可以将脊髓TOLL样受体4、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α水平降低，而对应的脊髓IL-10含量水平则会明显提升，通过这一作用机制减轻了大鼠模型对应的疼痛感，也就是说姜黄素在发挥镇痛期间过程中与脊髓TOLL样受体4信号通路以及促炎性因子的调节作用有关[16,17]。

神经病理性疼痛作为一类慢性疼痛疾病，患者血清中的皮质醇浓度存在异常，采用姜黄素治疗后可以降低血清中的皮质醇浓度，使其逐渐恢复到正常水平，并对背根神经节、脊髓背角等11-β羟基固醇脱氢酶活性产生抑制，使得患者在临床上疼痛程度降低[18]。在建立大鼠模型后，通过使用姜黄素进行治疗，模型大鼠的痛敏改善明显，这与脊髓背角神经元细胞凋亡减少有着密切关系[19]。当前关于姜黄素在镇痛方面的研究主要以背根神经节、脊髓背角、相关炎症因子以及酶活性为主，在不同作用机理方面也都进行了相关的研究，不过目前尚无达成共识，并且目前研究方向多以病理性疼痛为主，而对急性疼痛报道比较少。

本实验中，与对照组比较，切口痛组、姜黄素组及DMSO组机械性痛及热痛阈值均显著下降，而与切口痛组和DMSO组比较，姜黄素组机械性痛及热痛阈值有所上升，提示姜黄素对急性切口痛大鼠的急性痛有镇痛作用；与对照组比较，切口痛组、姜黄素组及DMSO组组蛋白H3K9甲基化表达水平均显著上升，而与切口痛组和DMSO组比较，姜黄素组组蛋白H3K9甲基化表达水平有所下降，提示姜黄素对急性切口痛大鼠的镇痛作用可能与抑制组蛋白H3K9甲基化表达有关。

综上所述，姜黄素可以减轻大鼠的急性疼痛，并降低了脊髓组蛋白甲基化水平的表达。