DNA甲基化和RNA甲基化修饰在复发性流产中的研究进展

陈钰,丁清锋,隋雪松,高路,2,3*

自然流产约占全部妊娠的15%,且多数为早期流产(妊娠不足12周)。流产可分为偶发性流产和复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA),欧洲人类生殖及胚胎学会(European Society of Human Reproduction and Embryology,ESHRE)指南将RSA定义为连续3次及以上的妊娠不足22周的流产,其具体病因仍不明确,目前被认为是多因素诱发的疾病[1]。

RSA的病因部分可由遗传学因素解释,例如夫妇染色体异常、女性关键基因突变或呈多态性等因素均可引起RSA[2-3]。但遗传学对流产的预测能力与全球日益加重的流产负担不相适应,仍有许多无法用遗传学因素阐明的患病机制。

近年来,DNA甲基化作用于配子发生、胚胎发育和母胎界面形成等一系列生殖过程的研究不断涌现,DNA甲基化异常可能会通过抑制胚胎中某些关键基因的表达,干扰胚胎的正常生长发育,从而导致RSA。虽然目前关于RNA甲基化异常与流产发病机制的研究尚不多,但已有新近研究发现RSA患者胎盘绒毛等组织中RNA甲基化异常现象。本文通过综述DNA甲基化和RNA甲基化修饰在RSA中的研究进展,加深对DNA甲基化和RNA甲基化修饰调控流产机制的理解,并有望为DNA甲基化和RNA甲基化修饰异常所致RSA的诊治提供新视角。

1 DNA甲基化修饰在RSA中的研究进展

DNA甲基化在表观遗传调控中发现最早、研究最深入,是哺乳动物基因表达调控的主要表观遗传学形式。在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下,以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体,DNA序列上特定的碱基将通过共价键结合的方式获得一个甲基基团,从而影响基因表达,但DNA脱氧核苷酸的顺序及其组成并未发生改变[4]。在胚胎发育过程中,配体甲基化模式在卵裂期至桑葚胚期被完全清除后,受精卵新甲基化模式进行重建,使非组织相关基因以及有害基因等沉默,并通过控制不同发育阶段以及不同组织器官内的DNA甲基化水平及模式,协调细胞谱系分化和器官发生[5-6]。DNA去甲基化对相关基因调控序列起激活作用,而DNA甲基化扮演的是“锁定”原先基因沉默效果的作用,防止已被沉默的基因发生“再激活”。因此,DNA甲基化异常的发现可以为机体健康与疾病提供理论基础。

DNA甲基化作用于胚胎发育、母胎界面形成等生殖过程,DNA甲基化异常可能会抑制胚胎中某些关键基因的表达,从而干扰胚胎的正常发育和生长,并导致RSA。

1.1 蜕膜中的DNA甲基化异常

多项研究表明,DNA甲基化异常在转录、翻译等多个阶段影响关键蛋白的表达,进而影响蜕膜化进程,减少滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭,流产风险显著增加。Xie等[7]发现,RSA蜕膜中长非编码RNA HZ08(long non-coding RNA,lncHZ08)启动子的DNA甲基化降低,介导lncHZ08转录的雌激素受体增加。lncHZ08表达增高抑制PI3K/pAKT/p-P21/CDK2通路,从而减少滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭,并进一步诱导流产的发生。Fatima等[8]发现在RSA患者蜕膜的转录本和蛋白质水平上观察到细胞凋亡与较高水平的p53表达之间呈正相关,凋亡相关蛋白Bax上调;而对照组DNA甲基化相关基因(dnmt1和g9a)以及p53甲基化水平高,抗凋亡蛋白Bcl-2上调,从而维持正常妊娠。

蜕膜在免疫耐受和维持妊娠之间保持微妙的平衡,DNA甲基化异常干扰蜕膜相关基因的表达,导致免疫耐受性下降、浸润失败和子宫螺旋动脉重构不良,可能引起植入不当、炎症和胎盘发育异常[9]。RSA蜕膜的DNA甲基化分析发现,cAMP应答元件结合蛋白5(cAMP responsive element binding protein 5,CREB5)基因的低甲基化导致CREB5和血清/糖皮质激素调节激酶3过度表达,可能通过调节免疫反应促进RSA的发生[10]。此外,研究发现RSA患者叉头样转录因子3(Foxp3)基因及调节性T细胞(Treg)特异性去甲基化区的甲基化水平显著高于对照组,可能是RSA患者CD4+T细胞中Foxp3基因的转录水平降低和Treg比例降低的原因之一[11]。

1.2 胎盘绒毛中的DNA甲基化异常

研究发现RSA患者的绒毛组织是低甲基化的,并伴有DNA甲基转移酶(DNMT 1/3a/3b等)的下调和DNA去甲基化酶(ten-eleven translocation 1/2/3,TET1/2/3)的上调。DNMT1和DNMT3a的表达降低会使滋养细胞的增殖受到抑制,最终导致胚胎植入率显著降低;而TET1和TET2在发育过程中通过影响细胞周期蛋白B1的表达,调节滋养细胞的完整性和细胞内复制周期,对胎儿的发育有重要影响[12]。由此导致的母胎界面胎盘绒毛中某些特异性基因的DNA甲基化异常可能与RSA的发生密切相关。比如,Wang等[13]发现RSA患者琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基DNA甲基化减少,导致胚胎植入率降低;Du等[14]证明含PR域蛋白1启动子的低甲基化诱导GATA2-FOXA1复合物的募集,促进滋养层细胞的迁移和凋亡;Wu等[15]提出胎盘绒毛中胰岛素生长因子2的DNA低甲基化可能影响早期妊娠的稳定性等。此外,胎盘的形成和定位是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和细胞外基质分泌的基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)之间平衡的结果,MMPs/TIMPs启动子甲基化水平升高会使MMPs/TIMPs失衡,从而导致子宫内膜基质过度降解和RSA发生[16]。尽管RSA患者的绒毛组织DNA总体上是甲基化的,但这并不代表所有与RSA相关联的关键蛋白DNA及其作用元件都是低甲基化。Matsumoto等[17]发现RSA患者绒毛膜中精子发生相关富含丝氨酸2样蛋白(spermatogenesis associated serine rich 2 like protein,SPATS2L)基因的增强子区域甲基化程度明显高于对照组,导致SPATS2L蛋白在前者的表达降低,影响侵袭和迁移能力,降低胚胎发育率。

基因组印记是父代等位基因通过配子传递给后代的过程,在发育过程中印记基因的甲基化状态具有组织特异性和阶段特异性。超过50%的已知印记基因在胎盘中表达,印记基因印记控制区的DNA甲基化异常可导致印记障碍或缺失,影响胎儿新陈代谢和神经发育,进而影响胚胎发育并导致不良妊娠结局。Sazhenova等[18]对120例RSA患者和134例偶发性流产患者绒毛膜细胞滋养层和胚胎外中胚层样本中7个印记基因的表观突变进行检测,并将100例人工流产样本作为对照组,结果表明RSA患者胎盘组织中印记基因的表观突变增多,导致RSA患者多位点印记障碍增多。其中NLRP7、KHDC3L、NLRP5、NLRP2和PADI6突变均会引起多位点印记障碍和胎儿发育停滞。在检测RSA绒毛样本中母代遗传印记基因GRB10和父代遗传印迹基因IGF2和PEG3的DNA甲基化模式时,Liu等[19]报告称两者均呈现显著的高DNA甲基化,其中PEG3的缺失和突变可能导致胎盘营养运输不足和子代生长迟缓,从而可能导致子代死亡。人类绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)在胚胎发育和妊娠维持中发挥重要作用,其编码基因绒毛促性腺素β肽5(chorionic gonadotropin β 5,CGB5)和CGB8携带胎盘表达的印记位点。当CREB5启动子在RSA中半甲基化时,hCG分泌减少,流产率显著增加[10]。亦有实验表明,RSA胎盘绒毛中其他众多印记基因(如H19/PEG1/LIT1/SNRPN)的甲基化水平显著高于对照组,可见胎盘绒毛中印记基因的异常高DNA甲基化从不同方面影响胎儿生长发育,诱导RSA的发生[20-21]。

1.3 RSA患者配偶精子中的DNA甲基化异常

除了母源因素外,RSA患者配偶精子的DNA甲基化异常会干扰精子发生和胚胎发育,导致着床异常,进而引起RSA。Camprubí等[22]分析了不育男性和对照组精子中H19-ICR、KvDMR、SNRPN-ICR、IG-DMR和MEG3-DMR的DNA甲基化谱,发现不育患者比正常组有更多的异常印记。El等[23]发现,流产组配偶精子内ALU重复序列的甲基化水平明显低于正常组。

1.4 非整倍体因素与DNA甲基化异常的相互作用

Vasilyev等[24]发现表观遗传机制与非整倍体发生之间可能存在关联。研究检测了流产患者绒毛膜中的19个长穿插核元件1(long interspersed nuclear elements,LINE-1)启动子CpG位点甲基化水平,结果表明,与对照组相比,三体和X单体流产绒毛膜绒毛的LINE-1甲基化水平升高,差异有统计学意义,LINE-1甲基化水平对不同非整倍体的流产具有特异性,且LINE-1甲基化水平随胎龄增加。Tolmacheva等[25]研究也确定了16三体流产绒毛膜中DNA甲基化的变化,发现在16三体流产中特定基因的启动子高甲基化具有特异性,且大多数差异DNA甲基化基因编码分泌蛋白、信号肽和具有二硫键的受体,其中某些基因在胎盘和胚胎发育(GATA3-AS1、TRPV6、SCL13A4、CALCB)及有丝分裂纺锤体的形成中发挥作用。

2 RNA甲基化修饰在RSA中的研究进展

与DNA甲基化类似,RNA甲基化也是基因表达的关键表观遗传学调控机制,目前已发现的RNA甲基化修饰包括6-甲基腺嘌呤(m6A)、5-甲基胞嘧啶和N1-甲基腺嘌呤等几种类型,其中尤以m6A修饰最具特征。RNA m6A甲基化修饰占总腺苷残基的0.1%～0.4%,普遍存在于RNA的DRACH保守序列(其中D=A、G或U;R=A或G;H=A、C或U)[26]。目前已经证实影响m6A修饰的三类蛋白质:甲基转移酶类(“书写”蛋白)、去甲基转移酶类(“擦除”蛋白)和甲基结合蛋白类(“读取”蛋白)。m6A甲基转移酶是一种复合物,由METTL3(methyltransferase-like protein 3)、METTL14、WTAP(Wilms’ tumor 1-associated protein)和VIRMA (vir-like m6A methyltransferase-associated protein) 等多组分共同构成,并在RNA甲基化中发挥催化作用。m6A去甲基转移酶FTO(fat mass and obesity-associated protein)和ALKBH5(alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5)的发现,证明了m6A修饰是可逆的,可通过甲基转移酶和去甲基转移酶动态调控m6A 修饰的甲基化过程[27-28]。RNA m6A修饰发挥生物学作用还需要结合相应的蛋白质,即m6A甲基结合蛋白,如YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)、YTHDC2、YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1)、YTHDF2和YTHDF3等[29]。RNA m6A修饰在一系列生物学过程中发挥调节作用,包括RNA新陈代谢、生长发育、细胞自噬和分裂、免疫调节和多种疾病等。新近研究表明RNA m6A修饰在流产中也发挥重要作用[30]。

Li等[31]发现RSA患者的胎盘绒毛组织中m6A甲基化水平显著降低,并通过绒毛外植体培养实验证明了在人滋养层细胞中ALKBH5基因敲除促进滋养层侵袭,而ALKBH5的过表达则抑制侵袭。进一步分析表明,滋养层中ALKBH5表达降低延长了半胱氨酸丰富血管生成诱导因子61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)mRNA的半衰期,增加了CYR61 mRNA的稳定性,从而促进滋养细胞侵袭。然而,Zheng等[32]发现, ALKBH5在缺氧处理时从细胞核转移到细胞质,通过消除SMAD1/5的m6A修饰来增强其表达,反而促进滋养层细胞的活性。Qiu等[33]发现自然流产患者绒毛膜中FTO表达相对降低,导致RNA甲基化异常和氧化应激,破坏了母胎界面的免疫耐受和血管生成,最终导致流产。Huang等[34]发现 m6A甲基转移酶METTL3在RSA组中显著降低;,通过在HTR-8细胞系中敲低METTL3,发现了METTL3的一个靶标锌指和含BTB域4(zinc finger and BTB domain containing 4,ZBTB4),揭示METTL3通过影响RNA m6A甲基化调控ZBTB4的稳定性和表达,进而调节RSA患者滋养层细胞的迁移与侵袭。

3 总结

在配子发生、胚胎发育和母胎界面形成等一系列生殖过程中,关键蛋白DNA或RNA发生甲基化异常,通过激活或抑制蛋白表达,均可导致流产。DNA甲基化异常在转录、翻译等多个阶段或影响蜕膜化进程中关键蛋白的表达,或减少滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭,或破坏免疫耐受和妊娠维持之间的平衡;母胎界面胎盘绒毛中某些印记基因的DNA甲基化异常在不同方面影响胎儿生长发育;精子DNA甲基化异常及其与胎儿非整倍体基因的相互作用等,都可诱导RSA的发生。此外,脐血中的一些关键DNA或RNA甲基化异常已被证实与流产有着密切联系,有望作为预测RSA的生物标志物。

然而,相比于DNA甲基化修饰在RSA中的研究,RNA甲基化修饰与RSA病因和发病机制关系的研究尚处于起步阶段,有待更多的科研工作者进行深入探索,以期为相关疾病的诊治提供新的理论依据。