代谢组学在妊娠期糖尿病中的研究进展

江志发,叶湘云,曹丹丹,蔡姗,李仲均,3*

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期最常见的并发症,国际糖尿病联合会估计妊娠期高血糖发生率约14%[1]。妊娠期高血糖会导致不良妊娠结局的风险增加,例如自然流产、子痫前期、胎儿异常、巨大胎儿、肩难产、新生儿低血糖和新生儿呼吸窘迫综合征等[2],最终导致母亲和后代发生代谢性疾病的风险增加[3]。近些年,随着高通量技术的发展,代谢组学已逐渐成为研究心血管和代谢性疾病(包括2型糖尿病和GDM)的公认有效研究方法[4]。目前使用代谢组学进行GDM发病机制研究的样本多样,现就不同样本类型的代谢组学研究进展进行综述。

1 代谢组学概述

代谢组学是在特定时期、特定阶段对特定生物体系(细胞、组织、体液或器官)进行代谢信息测定,通过定性、定量的方法分析小分子化合物在不同生理、病理或内外界条件刺激下出现的变化,进而了解研究对象功能状态的一种科学研究方法。代谢小分子是代谢活动的直接执行者[5],它能够直接显示个体特异性代谢信息。因此,代谢组学的检测结果可披露疾病过程、环境暴露、毒理变化和营养摄取等综合性信息[6-9]。代谢组学能对细胞或组织的特征进行实时描绘,能反映多个生理或病理进程信息整合,且可与基因或蛋白质等组学相结合,以便更全面地反映机体代谢表征。如通过对 2型糖尿病患者的血清代谢物进行靶向定量分析,同时进行基因组学检测,发现代谢通路中代谢产物变化与基因变化关系密切,推测基因多态性可能是引起代谢表型发生重要变化的原因[10]。这意味着可以通过整合多个组学信息,查找引起 GDM 病理生理变化中相关的生物学通路,明确差异代谢产物与 GDM 相关变异基因的关联性[11-12]。

2 妊娠糖尿病领域中代谢组学研究的标本类型

在GDM研究领域,使用代谢组学进行研究的主要标本类型有:血液、尿液、粪便、乳汁、毛发、羊水、胎盘、脐带血、胎粪等,其中血液最常见。

2.1 血液

人体的血容量相对稳定,个体差异不大,使用代谢组学分析血液最能反映研究对象当时的代谢状态[13]。妊娠早期使用血清标本进行代谢产物检测主要是为了筛选差异代谢产物。如Meng等[14]利用高效液相色谱-质谱串联技术(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)对糖尿病患者和健康人群的血浆进行对照研究,筛选出一组生物标志物,包括二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、花生四烯酸、柠檬酸、α-酮戊二酸和染料木黄酮等,并推测脂肪酸代谢异常可能是导致糖尿病发生的主要原因。Burzynska-Pedziwiatr等[15]研究表明,GDM血浆中2-羟基丁酸和3-羟基丁酸的含量明显升高,脂质分析显示肉豆蔻酸、油酸、花生四烯酸和α-亚油酸等14种脂肪酸差异显著。Zhang等[16]通过非靶向检测妊娠12～16周和妊娠24～28周的血浆代谢产物,分别鉴定出172种和478种差异代谢产物,其中40种重叠,且与GDM的发生机制相关,通过多反应监测分析显示妊娠早期17(S)-HDoHE和癸二酸水平升高,可成为妊娠早期预测GDM的生物标志物,妊娠中期17(S)-HDoHE和L-丝氨酸水平升高,可作为GDM的辅助诊断标志物。

2.2 尿液

鉴于尿液具有标本易得性、无创性,且有比较完整的代谢谱,使用尿液进行代谢组学研究也备受研究人员青睐。Koos等[17]通过收集GDM患者与健康孕妇孕早期的尿液,使用UPLC-MS/MS检测技术探讨了尿液中代谢产物的差异,结果显示两组孕妇尿液中存在626种差异代谢物,其中包括“二氢胡萝卜酸、苯酚葡萄糖醛酸苷、烟酸盐核糖核苷”等11种,主要和氨基酸、葡萄糖氧化和脂肪酸氧化相关,参与了抗氧化途径;研究表明与妊娠早期胰岛素抵抗和糖尿病代谢紊乱相一致。通路分析显示色氨酸代谢和嘌呤代谢的异常产物在代谢途径中最为重要,它们与2型糖尿病的发生有关[18]。López-Hernández等[19]使用LC-MS对35例孕妇妊娠期的尿液进行非靶向检测,筛选出14种差异代谢物(筛选标准:FC>1.5,P<0.05),通路分析显示色氨酸代谢和类固醇激素生物合成影响显著,差异代谢物也与糖尿病、糖耐量受损等疾病相关。虽然寻找妊娠早期或中期预测GDM的生物标记物是代谢组学研究的主要目标,但当妊娠中晚期GDM确诊时,研究其代谢改变也同样重要。通过鉴定GDM孕妇失调的代谢产物,找寻GDM的可能致病原因,同时研究失调的代谢途径有助于预测产妇不可逆的代谢效应。现有研究表明,色氨酸和嘌呤代谢失调是GDM的主要病理生理改变,色氨酸-犬尿氨酸和犬尿氨酸-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸代谢途径的失调是胰岛素抵抗的机制之一[20-21]。

2.3 粪便

粪便中的代谢物是肠道微生物群与宿主之间相互作用的关键信使,在宿主的生理病理学方面起重要的调节作用,包括短链脂肪酸和三甲胺氧化物[22-23]。肠道微生物群生态失调是GDM的特征性表象[24],因此肠道微生物群成为预测GDM生物标记物的又一个潜在来源。Liang等[25]通过H-NMR分析62例孕妇(GDM组31例、正常组31例)的孕晚期粪便,结果显示两组代谢物存在明显聚类分离现象,鉴定出二丁酯、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐、同型半胱氨酸、L-苹果酸和丁酮这5种差异代谢物,相对丰度显示,GDM组粪便中的同型半胱氨酸和丁酮含量升高,L-苹果酸等其他3种降低;空腹血糖与丁酮、同型半胱氨酸呈正相关,与L-苹果酸等呈负相关(P<0.01);差异代谢产物通路富集分析显示柠檬酸循环和硫代谢与GDM有关。柠檬酸盐循环是细胞的代谢中枢,在糖尿病中被抑制[26],由此可知GDM产妇肠道能量代谢和氧化还原受到了侵害。Dong等[27]对40名孕妇(GDM孕妇20例、正常孕妇20例)孕中期(妊娠34～28周)血浆进行代谢组学检测、孕晚期(孕37周)粪便进行16s rRNA测序,鉴定出5个差异血浆代谢物(甘油、乳酸、脯氨酸、半乳糖醇和甲基丙二酸)和98个粪便微生物群成员,多组学关联分析显示GDM孕妇肠道微生物群的变化导致高血糖相关血浆代谢物(包括脯氨酸、乳酸、半乳糖醇和甲基丙二酸)丰度改变。

2.4 毛发

头发具有高度稳定的结构,其基质中的化合物性质稳定且可无创获取,越来越多研究者选择头发作为暴露体进行代谢组学研究。研究者可以对单缕头发进行分段分析[28],找到长期暴露于已知致畸污染物(如烟草、酒精和药物)化学效应的记录[29]。因此,头发提供的代谢物谱,能够反映环境暴露对妊娠结局的长期影响。Delplancke等[30]采集了175例妊娠晚期孕妇的头发样本(GDM组11例、对照组73例、小于胎龄儿组20例)研究GDM、胎儿生长受限与正常体重胎儿的头发代谢差异,基于GC-MS平台分析各组头发的代谢物显示,78种代谢产物在妊娠三阶段发生显著变化,GDM组中妊娠晚期色氨酸、亮氨酸、柠檬酸等10种代谢物显著降低,而1-羟基-3-壬酮和22-氧维生素D3水平显著升高,KEEG通路分析显示碳水化合物代谢、能量代谢、异生素代谢和氨基酸代谢等通路显著富集。Chen等[31]于妊娠前、早孕期、中孕期和晚孕期时收集1 020名孕妇的头发(GDM组272例、对照组748例),使用GC-MS平台非靶向检测两组头发的代谢产物,鉴定出276种代谢产物,GDM组氨基酸和衍生物、脂肪酸、有机酸等10种代谢物在整个妊娠阶段均呈明显差异,其中4-羟基丁酸、肉豆蔻酸在妊娠各阶段均明显降低,经分析显示肉豆蔻酸与空气污染物PM2.5暴露呈显著负相关。既往研究显示己二酸在2型糖尿病患者的尿液中升高,是糖尿病患者氧化应激中发生脂质过氧化的产物[32]。陈旭阳等[33]采集93名孕妇孕26～28周(GDM组49例,对照组44例)的头发,运用LC-MS鉴定出545种代谢物,含31种差异代谢产物,其中GDM组中Amphibine H、油酰乙醇胺、3,4-Methylenepimelic acid等升高,而胡椒酸、刺桐碱等明显降低,头发代谢物KEEG通路分析显示38条差异性代谢通路,GDM组中碳水化合物、氨基酸、外源性物质降解等代谢通路均升高,油酰乙醇胺区分GDM的能力最好(ROC曲线下面积为0.846),可作为孕早期GDM高危孕妇的潜在生物标志物。

2.5 乳汁

母乳是婴儿生长发育的最佳食物,母乳喂养时间的长短和母乳成分在新生儿生长中起关键作用。母体循环代谢物的变化会影响乳汁的组成[34],而GDM会引起母体代谢紊乱,可能会影响乳汁的成分结构和母乳喂养的效果。Wu等[35]基于LC-MS/MS对100例孕妇(GDM组50例,对照组50例)的300个母乳样本(包括初乳、过渡乳和成熟乳)进行非靶向代谢组学检测,鉴定出羧酸、甘油磷脂、脂肪酰基、核苷酸等共计620种化合物,在GDM组初乳中,脂质、氨基酸、有机酸等5种代谢物增加,过渡乳中19种化合物增加,成熟乳中脂质、有机酸、核苷酸、维生素等18种升高,GDM组的4-吡哆醇是三阶段乳汁中均升高的唯一代谢物,GDM对成熟乳成分的影响远超初乳和过渡乳。通过Spearman相关性分析评估代谢物与新生儿体重的关联性,结果显示二十碳三烯酸和溶血磷脂酰胆碱与新生儿体重呈正相关,而磷酸肌酸、肌酸、d-谷氨酸、N-甲基-d-天冬氨酸、l-丝氨酸、磷胆碱、伊地醇、山梨糖醇、半乳糖醇和阿糖胞苷等10种与新生儿体重呈负相关。 母乳中含有激素和生长因子等生物活性成分,有助于婴儿组织的生长和分化[36-37]。Wen等[38]使用GC-MS对184例(GDM组90例、对照组94例)孕妇的初乳、过渡乳和成熟乳样品进行检测分析,结果显示,GDM组鉴定出58种差异代谢物,其中二十一烷、甘氨酸、甲酯、3-氨基异丁酸、谷氨酰胺等17种代谢物显著降低,而半胱氨酸、木质素、苹果酸等显著升高,初乳种氨基酸水平明显升高,游离脂肪酸显著下降。

2.6 羊水

羊水起源于母体和胎儿组织,包括来自胎盘、胎儿皮肤、肺、胃液和胎儿尿液的物质,采集羊水能直接测量胎儿在羊膜腔内的代谢物,提供有关妊娠期间胎儿器官发生和代谢的动态信息,有助于分析GDM早期的功能变化和途径,可为了解GDM如何改变胎盘-胎儿代谢提供新视角[39]。 O'Neill等[40]采用嵌套病例对照研究,按1:1配对,选取接受羊膜腔穿刺的40份羊水样本(GDM组20份,其中男胎10份、女胎10份),使用靶向代谢组学鉴定出69种差异代谢产物(性别特异性分析显示男胎44种、女胎58种),包括葡萄糖、氨基酸、谷胱甘肽、脂肪酸、鞘脂和胆汁酸代谢,且与性别差异相关;靶向同位素验证性测定显示,二十二碳六烯酸和花生四烯酸的变化差异性显著,游离脂肪酸的浓度随着甘油的增加而增加。由此表明,GDM孕妇妊娠早、中期胰岛素抵抗会引起母体脂肪过早分解,释放出更多的游离脂肪酸,使其透过胎盘并进入羊水。Zhou等[41]结合高脂肪饮食与低剂量链脲佐菌素注射建立GDM大鼠模型,通过剖宫产收集羊水和胎儿大鼠,应用LC-MS方法非靶向代谢组学检测出羊水中146种代谢物,其中68种上调,78种下调,血清中代谢物216种,其中91种上调,125种下调。羊水中的氨基酸、肽和类似物发生显著变化,羊水和血浆中有34种差异代谢物相同,且存在显著的关联,通路分析显示包括胆碱、色氨酸、组氨酸、烟酸盐和烟酰胺代谢路径发生改变,共生网络探索其与母胎结局的相关性表明,N1-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺、5'-甲基硫代肌苷和犬尿酸与母体空腹血糖和胎儿生长均有显著相关性,可用作GDM母胎健康状况的生物标志物。

2.7 胎盘

胎盘是母胎能量和营养转运最重要的器官,已有研究表明,胎盘在妊娠并发症中具有特殊的代谢特征,包括子痫前期[42]、自发性早产[43]、胎儿生长受限[44]等。通过研究胎盘代谢产物有可能揭示GDM母胎界面代谢异常的本质。Wang等[45]基于LC-MS/MS平台,对60例胎盘(GDM组20例、正常组40例)进行短链脂肪酸(SCFAs)和能量代谢中间体测定,结果显示GDM组中丁酸、乙酸和总SCFA明显降低,丙酸有下降,但差异无统计学意义;丁酸与乙酸、丙酸呈正相关;丙酸与胰岛素水平呈正相关;乙酸、丙酸、丁酸和白细胞计数组成的诊断模型可预测GDM(AUC=0.823,P=0.031,灵敏度83.3%,特异性79.5%);母体循环SCFAs(特别是乙酸、丙酸和丁酸)与GDM临床指标密切相关,有望成为潜在治疗靶点。Jiang等[46]通过非靶向脂质代谢研究显示,鉴定出1 202种阳性血脂和924种阴性血脂,其中63种脂质与GDM密切相关;失调的脂质主要集中为甘油磷脂和甘油脂;通路分析显示甘油磷脂代谢显著下调。有研究表明,脂肪酸摄取基因的相对mRNA表达在调节特定胎盘脂质的合成中起重要作用,具有一定的性别差异,胎盘棕榈酸和油酸的代谢具有胎儿性别依赖性差异,女性胎盘通常具有更大的脂肪酸摄取和产生能力[47]。

2.8 胎粪

胎粪于妊娠12周开始形成于胎儿体内,在口服葡萄糖耐量试验确诊GDM前已存在体内12～14周,如实地记录了GDM发展的子宫内历史环境变化[48]。Wu等[49]通过从1 359例孕妇中嵌套对照研究(GDM组137例,对照组197例),采集胎粪样本,采用电感耦合等离子体质谱或电感耦合等离子体发射光谱法和超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间平台进行微量元素和代谢组分析,结果显示,GDM组中砷、氢、镉、锡、铝和汞的中位数浓度显著升高,其中6种元素(镉、钡、铝、锡、砷、汞)与GDM呈正相关;包括精氨酸琥珀酸、甲基腺苷、四氢二吡啶甲酸酯、辛酰二羟基丙酮磷酸酯和牛磺十二酸等5种代谢产物升高,与GDM发生呈正相关,且与砷、钡、镉呈显著正相关,并主要参与了脂质代谢的代谢标志物和腺苷/L-精氨酸/一氧化氮途径介导。Chen等[50]通过研究418名孕妇(GDM组147例,对照组271例)及其新生儿的胎粪和和母体血清,418个胎粪样品全部用于16S rRNA基因测序,619个样品(304个胎粪和315个血液)基于高分辨液质联用分析仪进行代谢组分析,结果显示,GDM组胎粪微生物群落发生显著变化,新生儿的α多样性明显降低,在门水平上,GDM组变形杆菌、厚壁菌、拟杆菌和放线菌的丰度增加。胎粪代谢组分析表明,两组代谢物存在显著差异,鉴定出36种差异代谢物产物,包括核黄素和牛磺酸等22种丰度增加,甘油磷酸胆碱、肝胆酸等14种丰度降低。KEEG通路分析显示GDM组牛磺酸和次牛磺酸代谢、嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢、胆汁酸生物合成等7条代谢路径发生改变。同时发现糖胆酸、核黄素、牛磺酸等5种在GDM组中的新生儿胎粪和母体血清中出现相似的趋势变化。

2.9 胎儿脐带血

脐带是母胎连接的桥梁,脐带血代谢物可能反映胎儿的代谢状态,通过研究脐带血比较 GDM 与非 GDM 母子之间代谢物的差异,以此来了解妊娠高血糖对胎儿发育的影响。Barzilay 等[51]在妊娠中期(孕12～16周)收集孕妇外周血319份、分娩前外周血294份,分娩时脐静脉血284份,基于LC-MS/MS平台检测胆碱、甜菜碱和氧化三甲胺等物质,结果显示,GDM孕妇和对照组孕妇相比,脐血中叶酸、氧化三甲胺高于对照组,但甜菜碱水平低于对照组。而孕中期和分娩前的叶酸、红细胞叶酸、甜菜碱、氧化三甲胺、未转化的叶酸水平等差异无统计学意义,据此显示高血糖状态会影响GDM孕妇对一碳单位营养物质的吸收,这可能与GDM下的氧化应激状态有关。Yu等[52]对母体和胎儿脂肪酸代谢的观察性研究进行了荟萃分析,结果显示,GDM母亲脐带血中花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、n-3和n-6多不饱和脂肪酸水平明显低于对照组(P<0.05),胎儿脐血中多不饱和脂肪酸的绝对浓度和百分比均较低,GDM可能影响多不饱和脂肪酸从母亲到胎儿的转移。Zhu等[53]研究结果亦显示,内源性代谢的血浆磷脂n-6多不饱和脂肪酸(包括γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸和二十二碳四烯酸)在妊娠早期至中期GDM发展中有潜在作用,对葡萄糖-胰岛素稳态有潜在益处。在HAPO研究中也同样发现碳水化合物与氨基酸的代谢通路出现了紊乱。Ma等[54]通过对86份脐带血样本进行靶向代谢组学检测,对85种标准代谢物进行组间特异性差异分析显示,GDM组与高血糖组之间无显著差异,但GDM组、高血糖组与对照组差异显著;脐带血中大部分代谢物与新生儿体重呈负相关,其中包括熊去氧胆酸、二十二碳六烯酸等6种差异有统计学意义的代谢物。进一步通路分析显示代谢物主要参与3条路径,最丰富的通路是亚油酸和α-亚麻酸,妊娠期高血糖可能通过抑制亚油酸和α-亚麻酸代谢途径从而影响脐带血代谢。

3 总结与展望

通过基因组学和蛋白质组学能提示可能会发生什么,而代谢组学则能显示已经发生了什么。代谢组学能对细胞或组织的特征进行实时描绘,检测结果可披露疾病过程、环境暴露、毒理变化和营养摄取等综合性信息,且可与基因或蛋白质等组学相结合,更全面地反映机体代谢表征。在GDM研究领域,通过研究血液、尿液、毛发等各种类型的组织标本,已经发现诸多与GDM病理生理密切相关的差异代谢物,同时对这些代谢物的生物学特异性功能、由其构成的代谢通路和整体代谢网络等均做了大量研究,为进一步GDM病因学和发病机制研究提供了数据支撑。但是目前发现的大量GDM相关生物标记物,还缺乏大样本队列研究,有效性尚待进一步验证,同时妊娠期高血糖对患者及其子代的远期影响也有待于更深层次的研究。