微小miR-184在调控女性滋养层细胞凋亡中的作用及其分子机制探究

徐 霞,王鹏程,韩 璐

(上海交通大学医学院苏州九龙医院,江苏 苏州 215000)

人类胎盘的侵袭性绒毛外滋养层与成功的妊娠结局密切相关。它们重塑子宫螺旋动脉,以增加流向胎盘和发育中胎儿的血流和氧气输送[1-2]。滋养层细胞系的细胞活动,如滋养层的增殖、分化、迁移和侵袭,是健康妊娠的关键。由于滋养层侵袭与螺旋动脉重塑相关,甚至是其关键,而螺旋动脉重塑是成功胎盘形成的先决条件[3]。与上皮间质转化标志物(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关的一些特征已被证实,波形蛋白和N-钙黏蛋白作为间充质细胞的强制性标记,迄今为止尚未在EVT亚群中报道[4]。此外,据报道,两种非经典钙黏蛋白,血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)和钙黏蛋白-11(CDH-11)在人类胎盘滋养层细胞中表达。CDH-11和VE-cadherin被描述为ST和EVT的特征。已有研究表明,几种miRNA通过靶向不同的基因对HTR-8/SVneo细胞的凋亡产生调节作用,如靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的miR-30a-3p[4]、靶向肝细胞受体B4(EPHB4)[5]的miR-454,miR-320a靶向肝脏雌激素相关受体γ(ERRγ)[6],miR-423-5p靶向胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)[7],微小RNA-184(miR-184)靶向趋化因子12(CXCL12β)[8],miR-184靶向野生型p53诱导基因1(WIG1)[9]miR-210靶向Notch跨膜受体-1(NOTCH1)[10]。原位杂交显示,滋养层在胎盘中表达miR-184[11],而唐氏综合征胎儿胎盘中miR-184的表达上调[12]。在早发性重度子痫前期,miR-184通过靶向鞘氨醇1磷酸酯裂解酶1(SGPL1)增强滋养层细胞产生(IL-8)[13]。然而,miR-184在滋养层细胞中的功能仍不清楚[14]。本文进一步从女性滋养层细胞组织中miR-184表达水平、外源性miR-184表达水平,以及miR-184对细胞增殖、凋亡的影响进行研究,以全面掌握miR-184在女性滋养层细胞组织中的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂:HTR8/SVneo、Swan71和正常的上皮组织细胞,胎牛血清,头孢噻嗪(HT),300 μg/ml,100 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5 mol/L EDTA缓冲液,碱性裂解液:0.2 mol/L NaOH,1% SDS乙酸钠:3 mol/L KAc(pH 4.8);异丙醇70%乙醇;溴酚蓝,蔗糖指示剂。 TBE缓冲液,1%琼脂糖,溴化乙锭。 PI母液:500 μg/ml; Ho33342母液:2 mmol/L。

1.1.2 仪器和设备:荧光显微镜,电泳仪,电泳槽,微量取样器(1 ml,100 μl)0.5、1.5 ml离心管,载玻片,盖玻片。

1.2 实验方法 ①使用DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(10%)、制作细胞培养基进行样本细胞培养。②在培养基中添加10%的胎牛血清、青霉素、链霉素,将采集的女性滋养层细胞组织样本细胞在37 ℃和5%的CO2条件下进行培养。③将si-miR-184转染到女性滋养层细胞组织腺细胞HTR8/SVneo、Swan71中,完成转染后继续培养,同时设置空白载体和阴性对照组(Si-NC)一起进行培养,培养周期为2 d。④提取PCR进行反转录,以Primescript和SYBR primixextaq试剂作为转录试剂进行转录效率检测,对其转染率进行定量的检测和数据记录。

2 结 果

2.1 女性滋养层细胞组织中miR-184表达水平 在HTR8/SVneo细胞、Swan71细胞及正常细胞中miR-184表达水平依次为3.27±0.51、1.57±0.22、1.00±0.23,比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 女性滋养层细胞组织细胞中外源性miR-184表达水平 见图1。从结果可以看出,在正常上皮细胞中miR-184在转染后的细胞表达水平要比转染前低,而在女性滋养层细胞组织miR-184的表达水平比转染前的要高。并且从其相对表达量的直方图来看,相对表达量呈现明显的差异,在miR-184组中表现更为明显。经2 d的转染siR-NA后,miR-184在A549与HTR8/SVneo两种细胞中的表达水平比在转染之前更低(均P<0.05)。经2 d的转染pcDNA3．1-miR-184后,miR-184在A549细胞中的表达水平比转染之前更高(均P<0.05)。

A为上皮组织细胞组织;B为女性滋养层细胞组织中miR-184的表达

2.3 miR-184表达水平对细胞增殖的作用 si-miR-184促使miR-184的表达能够抑制HTR8/SVneo和Swan71细胞的增殖。在HTR8/SVneo细胞中,各时间段si-miR-184的吸光值与si-NC比较差异无统计学意义(均P>0.05),在A549细胞中,各时间段si-miR-184的吸光值明显低于si-NC(P<0.05)。见图2。

图2 miR-184表达水平对细胞增殖的作用

2.4 miR-184表达水平对细胞凋亡的作用 利用si-miR-184的转染降低miR-184的表达水平能够阻碍女性滋养层细胞的凋亡作用(P<0.01),而miR-184的过度表达能够明显推动女性滋养层细胞的凋亡作用(P<0.01)。见图3。

图3 miR-184表达水平对细胞凋亡的作用

3 讨 论

女性滋养层细胞凋亡是胎盘发育过程中发生的程序性细胞死亡,其潜在的调节机制负责胎盘的稳态。这些凋亡过程的改变可导致胎盘功能障碍,并导致各种病理状况。miRNA是破坏mRNA和(或)诱导翻译抑制的重要转录后调节因子,其在胎盘形成过程中调节滋养层细胞凋亡中起着关键作用[15]。然而,在女性滋养层细胞凋亡过程中,miRNA参与的分子调控机制仍不清楚。在本研究中,我们发现miR-184通过靶向髓细胞白血病基因1(MCL1)在调节HTR-8/SVneo细胞凋亡中起作用。越来越多的证据表明,miR-184在诱导多种细胞(主要是免疫细胞和肿瘤细胞)凋亡方面发挥着关键作用[16]。已有研究分析了miR-184在HTR-8/SVneo细胞中诱导凋亡,这表现出滋养层细胞的特征,滋养层细胞表达miR-184,在所谓的胎盘中观察到特别强烈的表达,但在胎盘中被IUGR下调。已有研究结果表明,miR-125可能参与正常胎盘形成和妊娠相关并发症,这些并发症通过诱导滋养层细胞凋亡而发生。

本文利用定量的反转录PCR技术滋养层细胞组织中miR-184的表达,通过测定miR-184在HTR8/SVneo和Swan71两种细胞中的相对表达水平作为女性滋养层细胞组织中miR-184表达水平[17]。测定经2 d培养周期的转染siR-NA后,miR-184在A549与HTR8/SVneo两种细胞中的表达水平作为女性滋养层细胞组织细胞中外源性miR-184表达水平。在HTR8/SVneo细胞中对各时间段si-miR-184的吸光值与si-NC差异分析miR-184表达水平对细胞增殖的作用,最后通过si-miR-184的转染方式降低miR-184的表达水平观察对女性滋养层细胞的凋亡影响[18]。

从实验结果来看,miR-184在HTR8/SVneo和Swan71两种细胞中的相对表达水平比在正常的上皮组织细胞中更高;在A549细胞中的相对表达水平比在正常的上皮组织细胞中更低;经2 d的转染siR-NA后,miR-184在A549与HTR8/SVneo两种细胞中的表达水平比在转染之前更低。同时通过细胞增殖对比实验,发现经2 d的转染真核表达载体pcDNA3.1的miR-184后,miR-184在A549细胞中的表达水平比转染之前更高(均P<0.05)。 转染miR-184促使miR-184的表达能够抑制HTR8/SVneo和Swan71细胞的增殖[19]。 在HTR8/SVneo细胞中,各时间段si-miR-184的吸光值与si-NC比较差异无统计学意义(均P>0.05),在A549细胞中,各时间段si-miR-184的吸光值明显低于si-NC(P<0.05);在进行的凋亡实验中,利用si-miR-184的转染降低miR-184的表达水平能够阻碍女性滋养层细胞的凋亡作用,而miR-184的过度表达能够明显推动女性滋养层细胞的凋亡作用[20]。

综上所述,实验结果表明可以通过从表达水平、细胞增殖和凋亡等多方面综合系统的分析了miR-184在女性滋养层细胞组织中的表达机制和其对细胞的增殖凋亡的影响,对后续进一步对女性滋养层细胞组织疾病的预防、治疗和早发现具有非常重要的参考价值。通过抑制miR-184表达可以调控和诱导滋养层的细胞凋亡的保护作用,临床上可以采用miR-184调节方式调控其滋养层细胞的凋亡来对滋养层细胞异常导致的相关疾病进行预防和治疗。