不同产地白术饮片HPLC指纹图谱研究

侯晓杰 郑 英 李 玮 张建锋

1．贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 5500025；2．贵州威利德制药有限公司，贵州 贵阳 550016

白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎。临床上白术炮制品主要有麸炒白术、土炒白术和焦白术等饮片，麸炒白术表面焦黄色或黄棕色，偶见焦斑，略有焦香气，具有缓和燥性、健脾消胀之功效，用于脾胃不和、运化失常、倦怠乏力和表虚自汗等症状[2-4]；土炒白术表面杏黄土色，附有细土末，有土香气，具有补脾止泻之功效，用于脾虚食少、泄泻便溏、胎动不安等症状[5-7]；焦白术不规则厚片，表面焦褐色，断面焦黄色，质松脆，略有焦香气，焦白术具有补气健脾、涩肠止泻的作用，主要用于慢性寒性腹泻[8-10]。因此，课题对不同区域白术饮片开展研究，建立指纹图谱共有模式，用于白术饮片质量控制，为白术质量评价提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞)；JT5003千分之一电子天平(余姚市金诺天平仪器公司)；ME204E万分之一电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，AUW220D十万分之一电子分析天平(苏州岛津仪器有限公司)；LDP-150高速万能粉碎机(浙江永康市红太阳机电有限公司)；DZ-2BC真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 材料 白术内酯Ⅰ对照品(批号：111975-201501)、白术内酯Ⅱ对照品(批号：111976-201501)、白术内酯Ⅲ对照品(批号：111978-201501)均购于中国食品药品检定研究院，以上对照品均供含量检测用。甲醇(色谱纯，天津科密欧公司)；乙腈(色谱纯，天津科密欧公司)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

收集不同产地的白术饮片，经贵州中医药大学生药教研室魏升华教授鉴定为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.经加工制成的饮片。

表1 12批不同产地白术饮片来源信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈-水，梯度洗脱(0～10 min，50%-70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A)，流速为1.0 mL.min-1，柱温为25 ℃，白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ检测波长为220 nm，白术内酯Ⅱ检测波长为276 nm，进样量20 μL。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称定白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ对照品适量，用甲醇溶解配制成质量浓度浓度分别为1.20 μg/mL、4.40 μg/mL、2.22 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称定白术饮片粉末(过3号筛)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，准确加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)40 min，取出，放置至室温，再次称定质量，用甲醇补足质量，摇匀，过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取白术药材粉末依照“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，以2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和峰面积，其结果分别为1.3%和1.9%，表明该方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取白术药材粉末6份，并依照“2.2.2”项下方法制备供试品平行溶液，按“2.1”项色谱条件下分别进样测定，以2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和峰面积，其结果分别为1.7%和2.2%，表明此方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取白术药材粉末依照“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，以2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和峰面积，其结果分别为1.6%和2.1%，表明24 h内样品溶液的成分稳定。

2.4 白术HPLC指纹图谱的建立及技术参数

2.4.1 白术HPLC指纹图谱的比较和分析 采集于我国不同地区的12批白术饮片，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，记录HPLC指纹图谱，然后将12批饮片的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012版(国家药典委员会)。进行色谱峰匹配，并生成对照指纹图谱，以建立的共有模式为参照图谱计算1～12批样品的相似度。

2.4.2 色谱峰指认 对不同的供试品色谱图的检测结果进行比较，本试验标定了12个指纹图谱中的共有峰，如图1所示，与混合对照品的指纹图谱进行比对，确认了2号峰白术内酯Ⅲ、5号峰为白术内酯Ⅰ、8号峰为白术内酯Ⅱ。从相似度数据(表2)和图2中可以看出不同地区的白术饮片相似度在0.963～0.999之间，均大于0.9，说明不同产地的白术所含化学成分大致相同。

图1 白术饮片HPLC对照指纹图谱

图2 12批白术饮片HPLC指纹图谱

表2 12批白术饮片指纹图谱相似度分析结果情况表

2.4.3 白术参照峰的标定 通过对12批不同产地白术饮片指纹图谱的测定结果进行比较，确定了12个色谱峰为共有峰，并选择了2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰。在白术药材指纹图谱中白术内酯Ⅲ保留时间适宜，峰形较稳定，白术内酯Ⅲ也是白术药材的主要成分之一，并且在所有白术饮片中为共有峰，因此选定白术内酯Ⅲ为参照峰。

表3 12批白术HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间统计表

表4 12批白术HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积统计表

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本试验利用紫外-可见分光光度计对白术样品溶液进行全波长扫描，经波长扫描发现白术样品溶液分别在243 nm，292 nm，376 nm 3个波长处有吸收。并利用高效液相色谱液对各波长进行考察。发现当检测波长为243 nm时，基线较稳定，呈现的吸收峰较多，峰面积相对较大，分离度好，峰形对称。本试验通过全波长扫描得到，样品在3个波长下有吸收，分别对3个波长进行比较，最终选择243 nm作为白术指纹图谱检测波长。

3.2 洗脱方式的选择 在实验过程中，选择等度洗脱和梯度洗脱两种方式进行研究，当使用等度洗脱，色谱峰在分离过程中分离度不理想，所以考虑使用梯度洗脱，以色谱峰的分离度和保留时间为指标，确定最终洗脱方式为梯度洗脱。

3.3 提取溶剂的选择 取白术粉末约1.0 g，精密称定，分别以甲醇和乙醇进行超声提取。以考察甲醇、乙醇作为提取的溶剂对白术样品溶液的指纹图谱，结果两种提取溶剂对白术样品差异不明显，且乙醇毒性较小，故本试验选择用乙醇进行提取。

3.4 提取溶剂质量分数的选择 本试验分别以100%、80%、60%乙醇作为溶剂考察对白术指纹图谱的影响。显示用100%乙醇作提取溶剂时，峰分离度较好，吸收较大，信息量大，故本试验选择用100%乙醇进行提取。

3.5 料液比的选择 本试验对比不同料液比的提取溶剂对白术进行提取，分别考察料液比为1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10对白术样品指纹图谱的影响。发现当料液比为1∶20时，峰分离度较好，吸收较大，信息量大，故选择1∶20为最佳料液比。

3.6 提取时间的选择 为了得到较好的提取效果，经查阅相关文献资料[7-8]，本试验分别考察超声提取60 min、40 min、20 min对白术样品的影响，当提取时间为40 min时峰分离度较好，吸收较大，信息量大，本试验以超声40 min来进行提取。

3.7 提取方法的选择 以文献中查阅的方法为依据[9-10]，分别进行回流提取、超声提取两种方法考察，分别比较两种提取方法下指纹图谱，结果显示，两种提取方法对白术指纹图谱色谱图无明显差异，为了操作方便，节约时间故选择超声提取。在研究白术指纹图谱提取方法时，分别从样品提取方法、提取溶剂、溶剂比例、提取时间进行了考察，通过试验结果，最终确定提取方法为加入100%乙醇20 mL超声40 min。

3.8 指纹图谱结果分析 通过建立白术饮片指纹图谱，对12批白术饮片指纹图谱进行分析研究，发现白术饮片HPLC共有峰的相对峰面积和共有保留时间具有较好稳定性，12批饮片相似度均大于0.90，说明虽然产地不同，生长环境多样化，但是白术的质量相对稳定。

综上，研究根据市场调研情况，对全国白术的道地产区分别采集样品进行研究，确保研究样品具有道地性、真实性和代表性，全面系统考察了检测波长、洗脱方式、提取溶剂、提取时间和料液比等条件，保证建立的方法较好的适用性和科学性。通过HPLC法对全国不同区域白术饮片进行研究，建立白术饮片指纹图谱研究方法，采用指纹图谱软件标定12个共有峰，并选择2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录12批次白术饮片的HPLC图谱，其相似度均大于0.90，说明该方法具有较好的专属性、重现性、稳定性和可控性，可作为白术种质资源、开发应用、加工方法和饮片标准等研究提供研究基础和技术方法，并能更加系统全面为白术相关的质量评价提供科学依据。