心阳片通过抑制AGEs介导的心脏成纤维细胞激活改善心力衰竭小鼠心肌纤维化的作用机制

梁碧容，周政，何嘉琪，刘景，张璐，黎欢，3，黄育生，3，王陵军（.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 50405；2. 广州中医药第一临床医学院，广东 广州 50405；3. 广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 50405）

心力衰竭是由于心脏结构或功能障碍导致心室充盈和射血能力受损而引起的一组临床综合征[1-2]，表现为心脏无法提供足够的血液维持各器官的代谢需求[1，3-4]。心力衰竭的发病率和死亡率居高不下，给医疗卫生系统带来巨大的负担[3，5]。心肌重塑是心力衰竭发展过程中的重要特征，而心肌纤维化在心肌重塑中发挥关键作用[6]。心肌纤维化是指细胞外基质蛋白在心脏组织中过度沉积，而活化的成纤维细胞是促进心肌纤维化发生的主要来源[7-8]。研究[9-11]显示，晚期糖基化终产物（Advanced glycation endproducts，AGEs）能够激活成纤维细胞，促进心肌纤维化发生，而抑制心脏成纤维细胞的激活可以有效改善心肌纤维化。

中医认为，心力衰竭的主要病机是气血阴阳虚衰、血瘀水停，治疗原则主要为调和阴阳气血，兼以活血利水[12-14]。心阳片是本课题组根据“益气温阳，活血利水”的治则研发的中药复方制剂，前期研究[15-16]表明，心阳片能够有效改善心力衰竭小鼠的心功能，减轻心肌纤维化。故本研究拟进一步探讨心阳片调控AGEs 介导的心脏成纤维细胞激活，从而改善心力衰竭小鼠心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物8 周龄C57BL/6J 雄性小鼠48 只，SPF级，体质量（25±2）g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：44005800008225，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034。本实验方案经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准，批文号：20180921001。

1.2 药物及主要试剂心阳片（由吉林参、淫羊藿、黄芪、益母草、毛冬青、葶苈子、车前子组成），由广州中医药大学第一附属医院提供，批号：20 180401；培哚普利叔丁胺片（雅施达），施维雅（天津）制药有限公司，批号： H20034053。AGEs 抗体，美国Proteintech 公司，批号：12148；GAPDH抗体（批号：2118）、二抗Anti-rabbit IgG（批号：7074），美国CST 公司；vimentin 抗体，英国Abcam公司，批号：92547；PVDF 膜、ECL 化学发光试剂（批号：P90720），美国Millipore 公司；动物组织总RNA 提取试剂盒（批号：DP431）、cDNA 第一链合成试剂盒（批号： KR202），北京天根生化科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010；Masson 染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号：G1340。

1.3 主要仪器Vevo2100 型高分辨率小动物超声机，加拿大Visual Sonics 公司； Inspira ASVv 容量控制小动物呼吸机，美国HARVARD 公司；Mastercycler®Nexus 梯度PCR 仪，德国Eppendorf 公司；CFX96 Touch 荧光定量PCR 检测系统、电泳及电转装置、全自动凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；Eclipse CI 型正置光学显微镜，日本Nikon 公司；Microfuge 20 小型高速离心机，美国Beckman 公司；TS 型多用脱色摇床，海门市其林贝尔仪器制造公司。

1.4 分组、模型复制及给药将48 只C57BL/6J 小鼠适应性饲养1 周后，随机分为6 组：假手术组、模型组、心阳片低剂量组、心阳片中剂量组、心阳片高剂量组及培哚普利组，每组8 只。

采用横向主动脉缩窄（Transverse aortic constriction，TAC）法建立心力衰竭小鼠模型：小鼠称定质量后，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）进行麻醉。将小鼠固定在恒温手术台上，气管插管连接呼吸机；沿左侧胸骨剪开至第二肋，分离双侧胸腺，暴露主动脉弓；根据主动脉弓直径选择27G 针头置于主动脉弓处进行结扎，然后取出针头；关闭胸腔，待小鼠恢复自主呼吸后拔出气管插管，然后进行常规饲养。假手术组暴露主动脉弓后，将丝线环绕主动脉弓，但并不进行结扎。术后4 周利用心脏彩超进行心功能检测，以左室射血分数（LVEF）低于50% 确认TAC小鼠造模成功。

按照60 kg 成人临床给药剂量（每日2.25 g）折算，心阳片低、中、高剂量组分别按照455、910、1 820 mg·kg-1灌胃给药；培哚普利组给予0.61 mg·kg-1培哚普利叔丁胺片灌胃给药；假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每天1 次，连续6 周。

1.5 超声心动图检测小鼠心功能小鼠连续给药6 周后，利用小动物超声机检测各组小鼠的心功能。小鼠吸入1%异氟烷进行麻醉后，采用超声机扫描评估心脏功能，收集LVEF 和左室短轴缩短率（LVFS）数据进行统计分析。

1.6 免疫组织化学法测定小鼠心脏组织AGEs 的表达将小鼠心脏组织放入4%多聚甲醛溶液固定过夜；然后用梯度浓度乙醇进行组织脱水；二甲苯透明1 h 后，石蜡包埋切片；然后脱蜡水化，进行抗原修复，以H2O2溶液室温下孵育10 min 阻断内源过氧化物酶；封闭后4 ℃下孵育一抗AGEs（1∶100）过夜；以二抗Anti-rabbit IgG（1∶1 000）孵育1 h；DAB染色后苏木精复染，脱水，二甲苯透明；中性树胶封片后，在显微镜下采集图像进行分析。

1.7 qPCR 法检测小鼠心脏组织中vimentin、FSP1及纤维化相关基因collagenI、collagen Ⅲ、CTGF、fibronectin 的mRNA 表达严格按照试剂盒说明书步骤操作，进行心脏组织RNA 提取和合成cDNA。将小鼠心脏组织加入组织裂解液后进行研磨，以13 400×g离心5 min，取上清；加入去蛋白液RW1、漂洗液RW，室温下静置、离心后得到总RNA；进行纯度及浓度检测；使用快速反转录试剂盒合成cDNA。所得cDNA 样本根据PCR 反应体系进行配制，进行PCR 扩增反应，反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5s，60 ℃、30 s，共40 个循环。扩增反应结束后进行扩增曲线和熔解曲线分析；以GAPDH 作为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。引物由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列见表1。

1.8 Western Blot 法检测小鼠心脏组织中vimentin蛋白的表达取小鼠心脏组织30 mg，加入裂解液进行研磨；以4 ℃、13 400×g离心5 min 后，取上清；采用BCA 蛋白浓度定量试剂盒测定样品蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，每孔蛋白上样量为30 μg，经SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜；用5%脱脂奶粉在室温下摇床封闭1 h，TBST 洗涤5 min；TBST 稀释一抗vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃下摇床孵育过夜；TBST 洗涤3 次，每次5 min，加入二抗（1∶5 000），室温下孵育1 h；TBST 洗涤3 次，每次5 min，然后进行化学发光反应；扫描后，使用ImageJ 软件计算蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.9 Masson 染色法观察小鼠心肌纤维化程度将小鼠心脏组织在4%多聚甲醛溶液中固定过夜，然后进行脱水、石蜡包埋、切片（4 μm），进行常规Masson染色后，在显微镜下观察、采集图像。

1.10 统计学处理方法采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用Tukey 检验，方差不齐则采用Dunnett’s T3 法检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心阳片对心力衰竭小鼠心功能的影响结果见图1。与假手术组比较，模型组小鼠的LVEF、LVFS显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，心阳片低、中、高剂量组及培哚普利组小鼠的LVEF、LVFS 均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，心阳片可以有效改善心力衰竭小鼠的心功能。

图1 心阳片对心力衰竭小鼠心功能的影响（±s，n=6）Figure 1 Effects of Xinyang Tablets on cardiac function in mice with heart failure（±s，n=6）

2.2 心阳片对心力衰竭小鼠心脏组织中AGEs 表达的影响结果见图2。与假手术组比较，模型组小鼠心脏组织中的AGEs 表达显著上调（P＜0.01）。与模型组比较，心阳片低、中、高剂量组及培哚普利组小鼠心脏组织中的AGEs 表达均显著下调（P＜0.01）。结果表明，心阳片能够抑制心力衰竭小鼠心脏组织中的AGEs 表达。

图2 心阳片对心力衰竭小鼠心脏组织中AGEs 表达的影响（免疫组化，×100；±s，n=3）Figure 2 The effect of Xinyang Tablets on the expression of AGEs in heart tissue of mice with heart failure（IHC，×100；±s，n=3）

2.3 心阳片对心力衰竭小鼠心脏组织中成纤维细胞标记物vimentin、FSP1 表达的影响结果见图3。与假手术组比较，模型组小鼠心脏组织中vimentin、FSP1 mRNA 表达及vimentin 蛋白表达明显上调（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，心阳片低、中、高剂量组及培哚普利组小鼠心脏组织中vimentin、FSP1 mRNA 表达及vimentin 蛋白表达均明显下调（P＜0.05，P＜0.01）。结果提示，心阳片能够抑制心力衰竭小鼠心脏组织中成纤维细胞的激活。

图3 心阳片对心力衰竭小鼠心脏组织中vimentin、FSP1 表达的影响（±s，n=3～4）Figure 3 Effects of Xinyang Tablets on the expressions of vimentin and FSP1 in heart tissue of mice with heart failure（±s，n=3-4）

2.4 心阳片对心力衰竭小鼠心肌纤维化的影响结果见图4。Masson 染色结果显示红色部分为肌纤维，蓝色部分为胶原纤维。与假手术组比较，模型组小鼠心脏组织中有大量胶原纤维沉积。与模型组比较，心阳片低、中、高剂量组及培哚普利组小鼠心脏组织中无明显胶原纤维沉积。结果表明，心阳片能够有效改善心力衰竭小鼠的心肌纤维化。

图4 心阳片对心力衰竭小鼠心肌纤维化的影响（Masson 染色，×100）Figure 4 The effect of Xinyang Tablets on myocardial fibrosis in mice with heart failure（Masson staining，×100）

2.5 心阳片对心力衰竭小鼠心脏组织中纤维化相关指标collagenI、collagenⅢ、fibronectin、CTGF mRNA表达的影响结果见图5。与假手术组比较，模型组小鼠心脏组织中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、CTGF、fibronectin mRNA 表达均显著上调（P＜0.01）。与模型组比较，心阳片低、中、高剂量组及培哚普利组小鼠心脏组织中collagenⅠ、collagen Ⅲ、fibronectin、CTGF mRNA 表达均明显下调（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 心阳片对心力衰竭小鼠心脏组织中collagenⅠ、collagenⅢ、fibronectin、CTGF mRNA 表达的影响（±s，n=4）Figure 5 Effects of Xinyang Tablets on the mRNA expressions of collagenⅠ，collagen Ⅲ，fibronectin and CTGF in heart tissue of mice with heart failure（±s，n=4）

3 讨论

心力衰竭是各种心血管疾病的终末期阶段，由于人口老龄化、心肌梗死后生存率提高等原因，其发病率在世界范围内显著升高[5，17]。高血压、糖尿病、高脂血症等是心力衰竭的基础病因，长期心脏压力过度负荷是导致心力衰竭发生的主要原因，以心脏重塑为重要特征。本研究采用TAC 法复制了心力衰竭小鼠模型，心脏肥大、心肌纤维化和炎症是该模型的主要特征[18]。炎症、纤维化与心力衰竭的发病机制密切相关[19]，改善炎症、心肌纤维化被认为是治疗心力衰竭的新策略[20-21]。

晚期糖基化终产物（AGEs）是一组在蛋白质、脂肪酸或核酸的氨基基团与还原糖的醛基之间发生非酶促糖基化反应所形成的一系列具有高度活性的终产物[22]。有研究[23-24]表明，AGEs 被认为是用于评估心力衰竭严重程度和预后的一种生物标志物。心力衰竭患者的AGEs 水平明显升高[25]。本研究结果也表明，与假手术组比较，心力衰竭模型组小鼠心脏组织中的AGEs 表达显著上调，进一步验证了AGEs 与心力衰竭的关系。此外，活化的成纤维细胞是心肌纤维化发生的主要效应细胞，发生心力衰竭时心脏成纤维细胞可分化成为肌成纤维细胞，分泌胶原和基质蛋白，胶原蛋白和基质蛋白过量沉积则导致心肌纤维化的发生[26]。因此，抑制成纤维细胞激活对改善心肌纤维化至关重要。本课题组前期研究[10]表明，AGEs 可以激活心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，从而促进心力衰竭中心肌纤维化的发生。本研究结果表明，心阳片可以升高心力衰竭小鼠的LVEF、LVFS，减少心肌纤维化面积，降低心脏组织中AGEs 表达，下调成纤维细胞标记物vimentin、FSP1 表达及纤维化相关指标collagen Ⅰ、collagenⅢ、fibronectin、CTGF mRNA 表达。提示心阳片可能通过调控AGEs 改善心力衰竭小鼠心功能和心肌纤维化。

中医根据心力衰竭的临床症状将其归属于“心水”“心衰”“悬饮”“水肿”“喘症”“心胀”等范畴，认为主要病因为外邪侵袭、劳倦内伤、饮食及七情所伤、脏腑失调[27]，属本虚标实、虚实夹杂，以心气亏虚为本，血瘀水停为标[28]。金代成无己在《伤寒明理论》中记载：“气虚停饮，阳气内弱，心下空虚，正气内动而悸也”，说明气阳虚是心力衰竭病机中不可或缺的因素[13]。基于心力衰竭的中医病因病机，其治则主要为益气温阳、活血利水[27]。心阳片能够有效改善心力衰竭患者的临床症状[29-30]，方中吉林参、黄芪均有补气的功效，黄芪还能利水消肿；淫羊藿补肾壮阳；益母草、毛冬青活血通脉、利尿消肿；兼以葶苈子、车前子加强利水消肿作用；全方共奏益气温阳、活血化瘀利水之功效。

综上所述，心阳片可以有效改善心力衰竭小鼠的心肌纤维化，可能与其抑制AGEs 介导的心脏成纤维细胞激活有关。