四物汤通过激活LKB1/AMPK通路对多囊卵巢综合征大鼠的改善作用

刘亚敏，张明昊，王瑾瑾，白莉，王灿（. 河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；. 河南中医药大学医学院，河南 郑州 450046）

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见的妇科内分泌疾病，常见的临床表现主要有排卵异常、高雄激素、卵巢呈现多囊样改变及胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）等[1-2]。根据其特征，中医临床常将PCOS 归为“不孕”“经迟”“闭经”“崩漏”等范畴，普遍认为其病因病机与肾虚、脾虚、肝郁、血瘀、冲任损伤、天癸失序、痰瘀胞宫等有关[3-4]。针对肾虚血瘀病机，多采用补肾活血化瘀的治法[5-9]。四物汤由当归、川芎、白芍、熟地黄四味中药组成，是养血补血活血的经典方[10-11]。临床研究[12]表明，四物汤合五子衍宗方加减能够改善PCOS 患者临床症状，缩短月经周期，提高妊娠率。卵巢颗粒细胞在维持卵巢功能方面有重要作用，四物汤能促进颗粒细胞增殖，改善PCOS 大鼠卵巢功能[13-14]。研究[15]还发现，当归水提物能通过改善高雄激素状态、减轻炎症反应和提高抗氧化水平达到治疗PCOS 的目的。四物汤可通过纠正PCOS 大鼠血清激素水平，一定程度上恢复下丘脑-垂体-卵巢性腺轴功能，改善卵巢排卵功能[16]。IR 是PCOS 的主要症状之一，而肝激酶B1（LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路与IR 密切相关[17]。研究[18]发现，枸杞多糖能够显著改善PCOS 大鼠的IR，调节性激素水平，修复卵巢病理改变，其机制可能与调节LKB1/AMPK 通路有关。故本研究拟基于LKB1/AMPK 通路探讨四物汤对PCOS 大鼠的治疗作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级健康雌性SD 大鼠，8 周龄，体质量（190±10）g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，实验动物生产许可证号：SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠分笼饲养于河南中医药大学医学机能实验室，大鼠自由饮水、摄食，适应性喂养1 周后开始实验。本实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会审批，批文号：DWLL202201010。

1.2 药物及试剂四物汤由当归9 g、川芎6 g、白芍6 g、熟地黄12 g 组成，药材购自郑州真心大药房股份有限公司，经河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定均为正品。冷水浸泡药材30 min 后，大火煮沸后转小火煎煮30 min，共煎煮3 次，合并药液并浓缩为1 g·mL-1四物汤水煎液。

来曲唑（批号：C12785740），上海麦克林生化科技有限公司；盐酸二甲双胍片（批号：20031702），上海寿如松药业泌阳制药有限公司；达英-35（批号：KT062FL2），德国拜耳医药保健有限公司；伊红染色液、苏木素染色液（批号分别为：20211009、190805），福州飞净生物科技有限公司；氨基甲酸乙酯（批号：20210902），天津市光复科技发展有限公司；葡萄糖（Glu）、胰岛素（Insulin）、雌二醇（Estrogen，E2）、睾酮（Testosterone，T）、促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）、促黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）、促卵泡素（Follicle stimulating hormone，FSH）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（批号分别为：F006-1-1、H203-1-2、H102-1、H090-1-2、H297、H206-1-2、H101-1-2），均购自南京建成生物工程研究所；DAB显色试剂盒、兔SP 试剂盒（批号分别为：ZLI-9018、SP-9001），北京中杉金桥生物技术有限公司；TriQuick 总RNA 提取试剂、cDNA 合成试剂盒、实时荧光定量PCR 扩增试剂（批号分别为：R1100、G3330、G3320）及兔抗大鼠LKB1、AMPK抗体（批号分别为：GB111236、GB111919），武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 主要仪器BS110S 型电子天平，北京赛多利斯天平公司；RM2235 型石蜡切片机，德国Leica 公司；MR-96TB 型酶标仪，骋克仪器（上海）有限公司；YD-6D 型组织包埋机、YD-A 型组织摊片机、YD-B 型组织烤片机，金华市科迪仪器设备有限公司；D3024R 型台式高速冷冻型微量离心机，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；Stepone plus 型荧光定量PCR 仪，美国ABI 公司；CX23 型光学显微镜，日本奥林巴斯公司。

1.4 模型复制将50 只雌性SD 大鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常组（10 只）、造模组（40 只）。正常组大鼠灌胃0.1% CMC-Na 溶液，造模组大鼠灌胃来曲唑混悬液，每日1 次，连续灌胃21 d。造模第16 天开始进行阴道涂片观察，光镜下可观察到大鼠阴道上皮细胞持续角化者为造模成功[19-20]。

1.5 分组及给药将造模成功的大鼠随机分为模型组、达英-35+二甲双胍组（0.2+230 mg·kg-1）和四物汤低、中、高剂量组（1.62、3.24、6.48 g·kg-1），每组10 只。四物汤、达英-35、二甲双胍的成人（70 kg）用量分别为36 g、2 mg、2.55 g，根据人与大鼠剂量换算公式（S200g大鼠=0.018×S70kg人）计算，四物汤、达英-35、二甲双胍的大鼠给药剂量分别为3.24 g·kg-1、0.2 mg·kg-1、230 mg·kg-1。本实验以等效剂量3.24 g·kg-1为四物汤中剂量，以中剂量的0.5、2 倍作为四物汤低（1.62 g·kg-1）、高（6.48 g·kg-1）剂量；以0.2、230 mg·kg-1分别为达英-35、二甲双胍给药剂量。上述药物均灌胃给药（10 mL·kg-1），正常组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水，每日1 次，连续30 d。

1.6 取材及处理各组大鼠禁食12 h 后，称体质量，腹腔注射1 g·kg-1氨基甲酸乙酯麻醉大鼠；腹主动脉取血，以3 000 r·min-1（离心半径=10 cm）离心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱。然后摘取卵巢，去除周围组织，用生理盐水洗涤；观察卵巢外观形态，用滤纸吸尽脏器表面液体后，称定质量；将卵巢组织分为2 份，1 份用4%多聚甲醛溶液固定后用于组织病理学分析，另1 份用液氮速冻后，-80 ℃保存。

1.7 ELISA 法检测大鼠血清中血糖、胰岛素、E2、T、GnRH、FSH、LH 水平取“1.6”项下制备的血清，室温下解冻后，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，检测血糖、胰岛素、E2、T、GnRH、FSH、LH 水平，并计算：IR 指数=空腹血糖值×空腹胰岛素值/22.5。

1.8 大鼠卵巢系数测定计算：大鼠卵巢系数=卵巢质量/体质量，依据卵巢系数评价卵巢病变程度。

1.9 大鼠卵巢组织病理形态学观察取“1.6”项下固定后的卵巢组织，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE 染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片等步骤，在光学显微镜下观察病理切片，并采集图像。

1.10 免疫组织化学法检测大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK 蛋白表达水平取“1.9”项下制备的卵巢组织切片，经二甲苯脱蜡、水化后，用柠檬酸盐缓冲液热修复8 min；待温度降至室温后依次用H2O2孵育10 min，PBS 浸洗，山羊血清孵育30 min；然后滴加LKB1（1∶2 000）、AMPK（1∶1 000）抗体，4 ℃下孵育过夜；次日，切片复温至37 ℃后，滴加生物素标记的羊抗兔二抗，孵育20 min；PBS 浸洗，DAB 显色10 min后，自来水冲洗终止；然后苏木素复染3 min，盐酸乙醇分化，自来水再次冲洗；切片经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜检。每只大鼠卵巢切片在400 倍镜下随机选取1 个视野，以棕黄色为阳性染色；采用Image-Pro Plus 6.0 软件测定每个视野中的积分光密度（Integrated Optical Density，IOD）值，并进行统计分析。

1.11 实时荧光定量PCR 法检测大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK mRNA 表达水平根据GenBank 数据库公布的大鼠LKB1（登录号：NM001108069.1）、AMPK（登录号：NM023991）、GAPDH（登录号：NM017008.4）基因序列，采用DNAStar 软件包的PrimerSelect 程序设计特异性引物，并由武汉塞维尔生物科技有限公司合成，引物序列见表1。取大鼠卵巢组织100 mg，加入1 mL TriQuick 试剂充分研磨匀浆后提取总RNA，检测RNA 浓度及纯度。在20 μL反应体系内合成cDNA，逆转录条件为：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 s；再以2 μL cDNA 为模板，加入靶基因上下游引物于15 μL 反应体系内进行PCR 扩增，扩增条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40 个循环；反应结束后，根据扩增曲线及熔解曲线判断PCR 反应特异性。结果以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平，并进行统计分析。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.12 统计学处理方法采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 法，方差不齐者采用Dunnett’s 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四物汤对PCOS 大鼠血糖、胰岛素水平及IR指数的影响结果见图1。与正常组比较，模型组大鼠的血糖、胰岛素水平及IR 指数明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和四物汤低、中、高剂量组大鼠的血糖、胰岛素水平及IR指数明显降低（P＜0.05）。结果表明，四物汤能降低PCOS 大鼠的血糖、胰岛素水平。

图1 四物汤对多囊卵巢综合征大鼠血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数的影响（±s，n=10）Figure 1 The effect of Siwu Decoction on the levels of blood glucose and insulin and insulin resistance index in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.2 四物汤对PCOS 大鼠血清E2、T、GnRH、FSH、LH 水平的影响结果见图2。与正常组比较，模型组大鼠血清中T、GnRH、LH 水平明显升高（P＜0.05），E2、FSH 水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和四物汤低、中、高剂量组大鼠血清中GnRH、LH 水平明显降低（P＜0.05），FSH 水平明显升高（P＜0.05）；达英-35+二甲双胍组和四物汤中剂量组大鼠血清中E2水平明显升高（P＜0.05），T 水平明显降低（P＜0.05）。结果表明，四物汤能升高PCOS 大鼠E2、FSH 水平，降低T、GnRH、LH 水平。

图2 四物汤对多囊卵巢综合征大鼠血清E2、T、GnRH、FSH、LH 水平的影响（±s，n=10）Figure 2 The effect of Siwu Decoction on the levels of E2，T，GnRH，FSH and LH in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.3 四物汤对PCOS 大鼠卵巢系数的影响结果见图3。与正常组比较，模型组大鼠的卵巢系数明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和四物汤低、中、高剂量组大鼠的卵巢系数明显降低（P＜0.05）。结果表明，四物汤能降低PCOS 大鼠的卵巢系数。

图3 四物汤对多囊卵巢综合征大鼠卵巢系数的影响（±s，n=10）Figure 3 The effect of Siwu Decoction on ovarian coefficient in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.4 四物汤对PCOS 大鼠卵巢组织病理变化的影响结果见图4。正常组大鼠卵巢组织结构完整，各级卵泡数量较多，发育良好，存在正常黄体和白体。模型组大鼠卵巢皮质胶原化，闭锁卵泡及无卵丘的囊性卵泡数量增多，卵泡颗粒细胞层数少。达英-35+二甲双胍组大鼠卵巢组织结构基本完整，各级卵泡形态完好，放射冠清晰，未见卵泡囊性改变，卵泡颗粒细胞层厚度增加，存在少量黄体和白体。四物汤低剂量组大鼠卵巢组织中可见较多的闭锁卵泡和无卵丘囊性卵泡，卵泡颗粒细胞层数少；四物汤中、高剂量组大鼠卵巢组织内含有各级卵泡，数量比例正常，颗粒细胞层厚度增加，放射冠清晰，存在少量黄体和白体，未见卵泡囊性改变。

图4 四物汤对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织病理变化的影响（HE 染色，×100）Figure 4 The effect of Siwu Decoction on pathological morphology micrograph of ovaries in polycystic ovary syndrome rats（HE staining，×100）

2.5 四物汤对PCOS 大鼠卵巢组织LKB1、AMPK

蛋白表达水平的影响结果见图5。与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和四物汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。结果表明，四物汤能上调PCOS 大鼠卵巢组织中的LKB1、AMPK 蛋白表达。

图5 四物汤对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织LKB1、AMPK 蛋白表达水平的影响（免疫组化，×400；±s，n=10）Figure 5 The effect of Siwu Decoction on the protein expression levels of LKB1 and AMPK in polycystic ovary syndrome rats（IHC，×400；±s，n=10）

2.6 四物汤对PCOS 大鼠卵巢组织LKB1、AMPK mRNA 表达水平的影响结果见图6。与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和四物汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）。结果表明，四物汤能上调PCOS 大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK mRNA 表达。

图6 四物汤对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织LKB1、AMPK mRNA 表达水平的影响（±s，n=10）Figure 6 The effect of Siwu Decoction on the mRNA levels of LKB1 and AMPK in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

3 讨论

多囊卵巢综合征（PCOS）是妇科常见的生殖功能障碍伴有糖代谢异常的内分泌紊乱综合征。其常见的临床表现及主要病理特征有持续排卵异常、月经紊乱、高雄激素、胰岛素抵抗（IR）、卵巢呈现多囊样改变、闭锁卵泡及无卵丘的囊性卵泡数量增多、卵泡颗粒细胞层数及成熟卵泡减少[21]。目前研究PCOS 的常用动物模型的造模方法有类固醇造模法、雄激素造模法、来曲唑造模法等。其中来曲唑造模法应用较为广泛，多项研究[22-23]将来曲唑造模法与其他造模法进行了比较，结果发现不管是从卵巢局部解剖学、形态学方面看，还是从性激素、蛋白表达水平方面比较，来曲唑造模法构建的PCOS 动物模型都更接近PCOS 的典型临床特征，且操作简单，对动物创伤性小，是研究PCOS 较理想的动物模型[24]。本研究结果显示，PCOS 模型大鼠卵巢稍增大且出现多囊性改变，血清T、GnRH 及LH 水平明显升高，E2、FSH 水平明显降低，且血糖、胰岛素水平及IR指数明显升高，表明造模成功。达英-35（炔雌醇环丙孕酮片）对PCOS 所致的高雄激素等症状有改善作用[25]，二甲双胍可以改善IR[26]，临床上常联合使用达英-35 和二甲双胍治疗PCOS[27-28]。因此，本研究采用达英-35 联合二甲双胍作为阳性对照药。

本研究结果显示，四物汤能增加PCOS 大鼠卵巢组织内各级卵泡数量，使囊性卵泡数量减少或消失，并且使颗粒细胞层增厚。PCOS 常常伴有卵泡排出障碍，导致卵巢增生[29]，而四物汤可以降低PCOS大鼠卵巢系数，缓解其增生进程。LH、FSH、E2和相应激素受体一起作用于卵巢，调控雌性机体的卵泡发育和排卵过程[30-31]。LH、FSH 的分泌受GnRH 的调控[32]。PCOS 患者分泌的GnRH 明显增多，引起LH水平升高、FSH 水平下降，而LH 水平升高可刺激卵泡膜细胞生成大量T，而FSH 水平下降则会影响T向雌激素转化的进程，从而导致卵巢内高雄激素，妨碍优势卵泡的发育和排出，进而形成卵巢多囊样改变[33-34]。同时，PCOS 患者分泌E2减少，也会导致卵泡闭锁和排卵障碍[35-37]。本研究结果显示，四物汤能升高PCOS 大鼠E2、FSH 水平，降低T、GnRH、LH 水平，表明四物汤对PCOS 大鼠的性激素分泌水平有一定的改善作用。

研究[38-40]发现，PCOS 常伴有IR，而LKB1/AMPK信号通路与IR 的产生相关。LKB1、AMPK 为真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛表达于各种组织。当细胞内一磷酸腺苷（AMP）/三磷酸腺苷（ATP）比值升高时，AMP 与AMPK-γ 调节亚基结合，磷酸化LKB1 为p-LKB1，p-LKB1 又与AMPK-α 亚基上的Thr172 位点结合，磷酸化该位点为p-AMPK，进而开启分解代谢途径以升高ATP 水平，同时关闭合成代谢途径以降低ATP 消耗，维持能量平衡[41-42]。有研究[43-44]表明，LKB1、AMPK 蛋白表达水平降低是IR 发生的关键环节，而有氧运动与膳食干预则能提高LKB1、AMPK 蛋白表达水平，进而改善IR。因此，推测PCOS 引起的IR 与LKB1/AMPK 通路的下调有关。研究[45]还发现，二甲双胍可以激活AMPK 通路，使糖酵解速度加快，提高胰岛素敏感性。本研究结果显示，PCOS 大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK蛋白及mRNA 表达水平明显下降，即LKB1/AMPK通路被抑制，而四物汤可以明显上调LKB1、AMPK蛋白及mRNA 表达水平，因此推测四物汤可能通过激活LKB1/AMPK 通路来发挥其对PCOS 的改善作用。

综上所述，四物汤对PCOS 大鼠性激素水平、IR及卵巢囊性改变具有明显改善作用，其机制可能与激活LKB1/AMPK 通路有关。本研究结果可为四物汤在PCOS 治疗方面的深入开发利用提供新的实验依据。