从微观血瘀角度探讨补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠的影响

韩云鹏，田津，刘立石，刘文雅，王翼轩，闫亚男，方朝义（.河北中医药大学基础医学院，河北 石家庄 050200；2.河北省中西医结合肺病研究重点实验室，河北 石家庄 05009）

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的纤维化性、慢性进行性间质肺炎，发病率呈增长趋势，其病理特点为弥漫性肺泡炎，及肺泡上皮细胞损伤和异常修复所致的肺间质进行性纤维化，导致肺功能不可逆下降[1]，症状多见干咳、劳累性呼吸困难和疲劳等。该病的病因病机尚未完全明确，主要有炎症反应、上皮细胞-间充质细胞转化、氧化应激和相关信号传导通路活化等相关学说[2-4]。IPF 属于中医学“肺痿”或“肺痹”范畴，临床多为气虚血瘀证型，常用补益肺气、活血通络之法[5]，补益肺气有助于提高患者免疫功能，活血通络则能改善肺脏微循环。补阳还五汤是补气活血通络的经典名方，被广泛用于IPF 的治疗，且具有较好疗效[6-8]。研究[9-13]发现，补阳还五汤能够通过多环节、多通道、多靶点发挥抗肺纤维化的作用，与调控炎性因子表达、干预上皮间质转化和内皮间质转化、抑制成纤维细胞增殖、维持氧化/抗氧化平衡、调节血管生成、保护肺血管内皮细胞、促进自噬激活，以及调控TGF-β/Smad/ERK、HMGB1、PTEN/mTOR 相关信号通路等有关。气虚引起推动血液运行能力下降，血瘀则致血流郁积于经脉或器官而呈现凝滞状态。故本研究拟通过观察血液流变学指标及肺小动脉的形态变化，从微观血瘀角度探讨实验性IPF 大鼠的气虚血瘀状态及补阳还五汤的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物6 周龄雄性SD 大鼠60 只，SPF 级，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006，实验动物质量合格证号：110011200107908327。大鼠饲养在标准动物房，自由进食标准饲料和纯净水。本动物实验经河北中医学院伦理委员会审查，伦理批文号：DWLL2020086。

1.2 药物及试剂补阳还五汤方剂组成：生黄芪120 g（批号：20200801）、当归尾6 g（批号：20200630）、赤芍4.5 g（批号：088200901）、川芎3 g（批号：098191202）、红花3 g（批号：20200701）、桃仁3 g（批号：20200912）、地龙3 g（批号：A190034001），每剂142.5 g，购自北京同仁堂药店，上述药材均经河北中医学院药学院张丹教授鉴定合格。所有药材以纯净水煎煮2 次，每次30 min，过滤去渣，药液保存于冰箱备用。

注射用盐酸博来霉素（Bleomycin，BLM），浙江翰晖制药有限公司，批号：20 067411；乙磺酸尼达尼布胶囊，德国勃林格殷格翰公司，批号： 900678；戊巴比妥钠，江苏艾康生物医药研发有限公司，批号：57-33-0。HE、Masson 染色试剂盒，珠海贝索生物技术有限公司，批号分别为：BA-4097、BA-4079A；乙二胺四乙酸二钾，北京华威锐科化工有限公司，批号：2001-94-7。

1.3 主要仪器LBY-N75008 型全自动血液流变仪，北京普利生仪器有限公司；Plus384 型酶标仪，美国Molecular Devices 公司；EG11508 型组织包埋机、HI1210 型摊片机、RM2255 型全自动轮转式切片机，德国徕卡公司；BX53 型显微镜，日本Olympus公司；3K15 型高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；WBP-RT4 型清醒动物肺功能检测系统，法国EMKA科技公司。

1.4 分组、模型复制及给药适应性喂养1 周后，将大鼠随机分为4 组：对照组、模型组、尼达尼布组（0.1 g·kg-1）、补阳还五汤组（14.84 g·kg-1），每组15 只。采用气管内滴注博来霉素建立IPF 大鼠模型[14]，具体操作如下：腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.04 g·kg-1）麻醉大鼠后，从颈部正中线切开皮肤，分开肌肉，暴露气管；用1 mL 注射器经气管软骨环间隙向心端刺入，缓慢滴注以生理盐水溶解的博来霉素（5 mg·kg-1）；滴注完毕后，迅速将鼠板直立并旋转，使药物均匀分布在大鼠两侧肺部；对照组采用同样方式滴注同等体积的去离子水。术后次日开始，除对照组外的其他各组均每日施加限制食量和睡眠剥夺刺激因素，以加重大鼠气虚血瘀状态。每日白天随机进行睡眠剥夺4 h（反复敲击鼠笼或更换鼠笼，以干扰其睡眠），20∶00 给予正常大鼠食量的2/3，连续干预28 d。大鼠于术后次日开始灌胃给药[15]，补阳还五汤组给予补阳还五汤中药煎液14.84 g·kg-1，尼达尼布组给予尼达尼布混悬液0.1 g·kg-1，对照组和模型组给予等体积去离子水10 mL·kg-1，每日1 次，连续28 d。

1.5 一般生物学表征比较观察大鼠的精神状态、皮毛色泽、摄食饮水、粪便、活动、呼吸等一般情况。重点观察大鼠有无气虚血瘀症状表现，如进食量减少，体质量降低，精神不振、喜蜷卧、喘息，活动性差，攻击性、对抗性行为减少或消失，粪便软或出现稀溏，毛发干燥无光泽，口唇、舌质色绛或紫暗，尾尖、尾根等部位出现青斑或皮下瘀紫，眼球更鲜红或暗红等[16]。分别于造模术前和术后第28 天对大鼠气虚血瘀症状进行量化评分[17-20]，每只大鼠由4 名实验人员独立完成评分，最终取平均值纳入统计分析。评分标准见表1。

表1 大鼠气虚血瘀证候评价量表Table 1 Evaluation scale of qi deficiency and blood stasis syndrome in rats

1.6 大鼠肺组织病理形态学观察将大鼠肺组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后，行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片机制备厚4 μm 组织切片，行HE、Masson 常规染色，在光学显微镜下观察。HE 染色结果以Szapiel 评分体系评价肺泡炎性程度[14]，Masson 染色结果采用Ashcroft 评分体系评价大鼠肺组织纤维化情况[21]。分别在200 倍视野下，每组选取8 个视野进行评价，具体评分标准见表2、表3。

表2 Szapiel 评分体系Table 2 The Szapiel scoring system

表3 Ashcroft 评分体系Table 3 The Ashcroft scoring system

1.7 旷场实验第0、7、14、28 天通过旷场实验检测大鼠行为学变化。实验所用旷场箱底面为1 m×1 m的正方形，外围高40 cm 挡板，形成一个无盖箱体。旷场箱底面划分为25 块20 cm×20 cm 的正方形小格，贴近四壁的小格称为“外周格”（共16 格），其余为“中央区”（共9 格），中央区最中心的1 个小格为“中心格”。实验人员将大鼠轻轻放进中心格，30 s 后开始计时，观察大鼠在5 min 之内的运动轨迹、运动总距离、进入中央区次数及进入中心格次数。

1.8 血液流变学检测取大鼠股动脉血液2 mL 抗凝，常温下静置30 min 后，采用全自动血液流变仪检测全血低切变率（10 s-1）、中切变率（60 s-1）、高切变率（150 s-1）、红细胞压积、聚集指数和电泳指数。

1.9 评估肺小动脉病理变化程度取“1.6”项下的HE 染色切片，在200 倍镜下选取4 个视野，并以400 倍镜放大。然后采用Image-pro Plus 6.0 图像分析软件计算肺小动脉管壁厚度、血管外径、管腔面积、血管总面积，并计算出肺小动脉管壁厚度与血管外径比值（WT%）、管壁面积与血管总面积比值（WA%），取其平均值进行统计分析，以评价肺小动脉病理变化程度。

1.10 统计学处理方法采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用SNK-q检验；若所测数据不符合正态分布及方差齐性，则采用非参数检验中的多个独立样本的Kruskal-WallisH检验，两两比较则采用SNK-q检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补阳还五汤对IPF 大鼠一般生物学表征及气虚血瘀证候评分的影响造模前各组大鼠精神状态良好，行动活泼，反应灵敏，皮毛光泽，摄食饮水、排便均正常，体质量差异不明显。造模后大鼠呼吸浅快，继而呼吸急促，甚至出现哮鸣音，鼻头、口唇和爪甲紫暗，毛发日渐色暗干枯，后期有大量毛发脱落。给药组大鼠经药物干预后，摄食量有所增加，呼吸较为平稳，鼻头、口唇和爪甲出现轻度紫暗，毛发枯黄掉落等现象减少。气虚血瘀证候评分结果见图1。与对照组比较，模型组大鼠气虚血瘀证候评分显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，尼达尼布和补阳还五汤组大鼠的气虚血瘀证候评分显著下降（P＜0.01）。与尼达尼布组比较，补阳还五汤组大鼠的气虚血瘀证候评分明显下降（P＜0.05）。结果表明，补阳还五汤能够明显改善IPF 大鼠的气虚血瘀症状，且效果优于尼达尼布。

图1 补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠气虚血瘀证候评分的影响（±s，n=15）Figure 1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the score of qi deficiency and blood stasis syndrome in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.2 补阳还五汤对IPF 大鼠肺组织病理形态学变化的影响结果见图2、图3。对照组大鼠肺组织无明显病理变化，结构清晰，肺泡壁完整、连续。与对照组比较，模型组大鼠肺组织结构紊乱，肺泡结构有不同程度破坏，肺泡腔及肺间质可见大量炎性细胞浸润，肺间质中可见明显的成纤维细胞聚集和大量的胶原沉积，Szapiel 评分及Ashcroft 评分均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，尼达尼布组和补阳还五汤组大鼠肺泡结构相对完整，炎性细胞浸润、胶原沉积和成纤维细胞聚积明显减轻，Szapiel 评分及Ashcroft 评分显著降低（P＜0.01）。结果表明，补阳还五汤能够改善IPF 大鼠肺组织的炎症及纤维化程度。

图2 补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠肺组织病理形态学变化的影响Figure 2 Effect of Buyang Huanwu Decoction on pathological changes of lung tissue in rats with idiopathic pulmonary fibrosis

图3 补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠肺组织Szapiel 评分、Ashcroft评分的影响（±s，n=8）Figure 3Effect of Buyang Huanwu Decoction on Szapiel and Ashcroft scores of lung tissue in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=8）

2.3 补阳还五汤对IPF 大鼠行为学变化的影响结果见图4。与对照组比较，模型组大鼠第28 天的运动总距离、进入中央区次数及中心格次数均显著减少（P＜0.01）。与模型组比较，尼达尼布组及补阳还五汤组大鼠第28 天的运动总距离、进入中央区次数及中心格次数均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。与尼达尼布组比较， 补阳还五汤组大鼠第28 天的运动总距离明显增加（P＜0.05）。

图4 补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠行为学变化的影响（±s，n=15）Figure 4 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the behaviors of rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.4 补阳还五汤对IPF 大鼠血液流变学指标的影响结果见图5。与对照组比较，模型组大鼠的全血低切、中切和高切黏度及红细胞压积、聚集指数、电泳指数均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，尼达尼布组及补阳还五汤组大鼠的全血低切、中切和高切黏度及红细胞压积、聚集指数、电泳指数均明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠血液流变学指标的影响（±s，n=15）Figure 5 Effect of Buyang Huanwu Decoction on hemorheology of rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.5 补阳还五汤对IPF 大鼠肺小动脉病理变化的影响结果见图6。与对照组比较，模型组大鼠的肺小动脉管壁厚度、肺小动脉管壁厚度与血管外径比值、管壁面积与血管总面积比值均显著增加（P＜0.01），肺小动脉形态发生明显改变，并且肺小动脉主要分布在肺间质，围绕着肺小动脉有较多的肺间质增生。与模型组比较，尼达尼布组和补阳还五汤组大鼠的肺小动脉管壁厚度、肺小动脉管壁厚度与血管外径比值、管壁面积与血管总面积比值均显著降低（P＜0.01）。

图6 补阳还五汤对特发性肺纤维化大鼠肺小动脉病理变化的影响（HE 染色；±s，n=4）Figure 6 Effect of Buyang Huanwu Decoction on pathological changes of pulmonary arterioles in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（HE staining；±s，n=4）

3 讨论

研究[22]表明，气管内一次性或重复注入博来霉素可复制与人肺间质纤维化病理过程相似的动物模型，是目前研究特发性肺纤维化（IPF）的常用造模方法。气管内注入博来霉素导致大鼠呈现肺纤维化病理改变的同时，还存在典型的气虚血瘀状态[23]，本研究采用气管内滴注博来霉素结合限制食量及睡眠剥夺作为刺激因素[24-27]，构建了气虚血瘀IPF 大鼠证候模型。本研究结果表明，模型大鼠逐渐出现肺泡实变和肺间质纤维化增生，Szapiel 评分、Ashcroft 评分均显著升高，符合IPF 的主要病理特征[28-30]；大鼠喜蜷卧，大便质稀量多，毛发日渐枯槁无光泽，活动探索时间下降，呼吸浅快或急促，甚至出现哮鸣音，表现出气虚相关症状；鼻头、口唇和尾尖紫暗，或有瘀斑，血液流变学指标明显改变，出现肺小动脉壁厚度增加、管腔变窄等病理变化，判断为典型的血瘀之象；结合气虚血瘀证候评分结果，表明IPF 大鼠出现明显的气虚血瘀状态，模型复制成功。

补阳还五汤由生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙组成，具有补气活血、祛瘀通络的功效，常用于气虚血瘀型IPF 的治疗。方中重用生黄芪为君药，大补脾肺之气，且寓培土生金之意，肺气旺则助心行血之功益昌，血自流经，瘀无由生，络脉通，玄府畅。臣以当归尾，其长于活血，兼可养血，在活血化瘀同时尚可化生新血。赤芍清热凉血，活血祛瘀，助归尾行血之力，使肺脏络活气宁；川芎活血行气，走而不守，行散血瘀力强；桃仁活血祛瘀以通肺络，润燥滑肠以行腑气，腑气得通则肺气自降，一药而兼三用，其功皆在保肺；红花亦可活血畅通肺络以利玄府。使药地龙通经活络，可疏通微小血管之瘀。全方共奏益气活血、通络开玄之效，为益气活血之代表方，亦契合IPF 气虚血瘀之病机。其益气活血通络以使肺脏气血得到充盈，脏腑组织得以充养；活血祛瘀开玄，又能促进病理产物代谢，改善血液循环，从而缓解肺纤维化之“血瘀”表现。

本研究结果表明，补阳还五汤可显著改善IPF大鼠肺组织病理变化以及气虚血瘀状态，可能与其降低全血黏度、抑制肺小动脉血管病变，从而增强肺功能有关。本研究从微观血瘀角度观察了补阳还五汤对IPF 大鼠的影响，可为临床应用益气活血法治疗IPF 提供参考，但更深层次的作用机制有待深入研究。