湖北雪茄烟叶致霉菌分离鉴定及芽胞杆菌属拮抗菌株筛选

张岱源，叶长文，李 栋，刘丹丹，魏雪团，黄 阔*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州市高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 华中农业大学食品科学技术学院，武汉市洪山区狮子山街1 号 430070

雪茄烟是由雪茄烟叶卷制而成的烟草制品，雪茄烟叶品质是决定雪茄烟质量的关键［1］。然而，雪茄烟叶营养物质丰富，在适宜环境条件下极易滋生霉菌［2］，导致烟叶组织结构被破坏，出现霉腐臭味，且部分霉菌还可能产生毒素［3-4］，严重影响雪茄烟烟叶原料品质［5-6］。烟叶霉变防控方法主要包括物理防霉法、化学防霉法和生物防霉法［7-9］。其中，物理防霉法主要包括辐照防霉法和微波防霉法，这两种方法可能会影响烟叶品质，且存在效果不佳、能耗大和成本高等问题，因此未被推广［10］。化学防霉法通常利用山梨酸（盐）类、苯甲酸（盐）类及羟基苯甲酸（盐）类等防霉剂干预霉菌的生长，但这些防霉剂对烟叶的感官品质易造成不良影响，故其应用受到限制［11］。生物防霉法主要利用微生物或微生物的代谢产物抑制或杀死霉菌，从而防止烟叶霉变的发生，该方法具有安全环保、高效无污染等优点［12］，应用前景广阔。其中，芽胞杆菌属（Bacillus）微生物具有对霉菌拮抗能力强、安全性高等特点，在拮抗霉菌的菌株中优势明显［13-16］。陈倩倩等［17］通过琼脂平板打孔法发现枯草芽胞杆菌FJAT-5561（Bacillus subtilisFJAT-5561）对青霉属（Penicillium）霉菌有较强拮抗能力；赵文姬［18］采用平板对峙法筛选到一株解淀粉芽胞杆菌B055（Bacillus amyloliquefaciensB055），该菌株对烤烟烟叶具有良好的防霉效果；卢灿华等［19］从烤烟内生细菌中分离得到一株枯草芽胞杆菌Z002（Bacillus subtilisZ002），该菌株对烤烟烟叶致霉菌少根根霉（Rhizopus arrhizus）的防效高达97%。然而，利用芽胞杆菌属（Bacillus）微生物对雪茄烟叶进行霉变防控的相关研究还鲜见报道。因此，分离、纯化湖北霉变雪茄烟叶中的霉菌，利用纯化后的霉菌对烟叶进行回接侵染确定致霉菌，采用牛津杯抑菌法筛选对致霉菌拮抗能力强且具广谱抗霉能力的芽胞杆菌属（Bacillus）微生物，并分析其对雪茄烟叶的防霉效果，旨在为雪茄烟叶的生物防霉提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 雪茄烟叶样品采集

雪茄烟叶样品采集于湖北省恩施市来凤县雪茄烟发酵工厂，茄芯烟叶品种为楚雪14 号，茄衣烟叶品种为楚雪10 号，取样时间为2021 年10 月21日。选取湖北省宜昌市发酵前、后茄芯和十堰市发酵前、后茄衣4种霉变样品用于霉菌分离。另外，选取宜昌市发酵前茄衣、发酵后茄衣、发酵后茄芯和十堰市发酵前茄衣4种正常未霉变雪茄烟叶样品用于拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物筛选、烟叶抗霉菌侵染能力分析、霉菌致霉性分析及拮抗菌株防霉效果分析。取各烟叶样品2 kg 装于无菌采样袋，使用低温保藏箱转移至实验室并保存于-20 ℃冰箱中。

1.1.2 培养基配方

孟加拉红琼脂培养基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁（无水）0.5 g/L，孟加拉红0.033 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂20 g/L；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂20 g/L；LB 液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L；LB固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15 g/L；沙氏液体培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L；沙氏固体培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，琼脂15 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 雪茄烟叶中致霉菌的分离、纯化与鉴定

1.2.1.1 雪茄烟叶中霉菌的分离、纯化

参照GB 4789.15—2016［20］的方法，称取4 种霉变雪茄烟叶样品各25 g，分别加入225 mL 无菌水，充分振荡后将所得液体按照10-2、10-3和10-4进行梯度稀释，采用平板倾注法将稀释液分别接种于孟加拉红琼脂培养基平板，28 ℃恒温培养3 d 后对各平板中的菌落进行计数，选择数量多且形态差异明显的5 个单菌落，分别进行纯化得到进一步纯化的单菌落，将其分别命名为ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4 和ZT-5。

1.2.1.2 雪茄烟叶中霉菌的鉴定

形态学鉴定：将得到的5株霉菌分别接种于5个PDA培养基平板中央，28 ℃恒温培养3 d，观察霉菌菌落颜色，并在3 d内每隔12 h记录各霉菌的生长情况。挑取各菌落边缘菌丝分别制备玻片，使用光学显微镜（德国Leica 公司）观察霉菌孢子形态和产孢结构。

分子生物学鉴定：使用真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取5株霉菌的基因组DNA，并以提取的DNA 为模板，利用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）对霉菌ITS 区进行PCR 扩 增。PCR 反 应 体 系：5 μL 5×TransStart®FastPfuBuffer，2.5 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL 上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL模板DNA，1 μLFastPfuDNA Polymerase（2.5 U/μL），加ddH2O 补至25 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环30 次；72 ℃延伸5 min。PCR 产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，使用NCBI BLAST 在线工具将测序结果与NCBI 数据库中已有真菌的ITS 序列进行同源性比对。使用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.1.3 不同雪茄烟叶抗霉菌侵染能力

称取4 种烟叶各5 g 分别置于4 个250 mL 锥形瓶中，在瓶口处喷洒3.5 mL 1.2.1.1 节中得到的5 株霉菌的混合孢子悬浮液（孢子浓度2×104CFU/mL）。上述操作重复3次，28 ℃恒温培养箱放置4 d。烟叶表面无霉菌菌丝覆盖且烟叶无霉臭味则该烟叶抗霉菌侵染能力强，烟叶表面有霉菌菌丝覆盖且烟叶有霉臭味则该烟叶抗霉菌侵染能力弱［21］。

1.2.1.4 雪茄烟叶中霉菌的致霉性

称取6 份1.2.1.3 节中抗霉菌侵染能力弱的烟叶各5 g 分别置于6 个250 mL 锥形瓶，分别对各烟叶进行处理（处理1-1：喷洒3.5 mL无菌水；处理1-2：喷洒3.5 mL 菌株ZT-3 孢子悬浮液，孢子浓度为2×104CFU/mL；处理1-3：喷洒3.5 mL 菌株ZT-5 孢子悬浮液，孢子浓度为2×104CFU/mL；处理1-4：喷洒3.5 mL菌株ZT-1 孢子悬浮液，孢子浓度为2×104CFU/mL；处理1-5：喷洒3.5 mL菌株ZT-2孢子悬浮液，孢子浓度为2×104CFU/mL；处理1-6：喷洒3.5 mL菌株ZT-4孢子悬浮液，孢子浓度为2×104CFU/mL）。上述操作重复3次，28 ℃恒温培养箱放置4 d。烟叶表面无霉菌菌丝覆盖且烟叶无霉臭味则该霉菌致霉性弱，烟叶表面有霉菌菌丝覆盖且烟叶有霉臭味则该霉菌致霉性强。

1.2.2 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的筛选与鉴定

1.2.2.1 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的分离、纯化

称取2 g 未霉变雪茄烟叶，加入18 mL 无菌水，37 ℃、180 r/min 摇床振荡2 h，将其按照体积分数3%接种至5 mL LB液体培养基，37 ℃、180 r/min摇床振荡12 h。将所得液体按照10-2、10-3和10-4进行梯度稀释后分别涂布于LB 固体培养基平板，37 ℃恒温培养12 h。挑取各平板上的单菌落分别进行纯化，得到进一步纯化的单菌落并编号。

1.2.2.2 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的初步筛选

采用牛津杯抑菌法［22］，将10 mL 加热后冷却至40 ℃的沙氏固体培养基与100 μL 1.2.1.4 节中致霉性强的霉菌孢子悬浮液（孢子浓度2×105CFU/mL）混合后倒入直径为90 mm的培养皿中。将牛津杯置于凝固后的培养基上，再次倒入40 ℃沙氏固体培养基，待培养基凝固后取出牛津杯，培养基平板上形成琼脂孔，将1.2.2.1 节中芽胞杆菌属（Bacillus）菌株的菌液（菌液浓度108CFU/mL）加入琼脂孔中。28 ℃培养5 d 后挑选出能形成抑菌圈的芽胞杆菌属（Bacillus）菌株。

1.2.2.3 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的抑菌谱

采用牛津杯抑菌法，测量初步筛选出的芽胞杆菌属（Bacillus）菌株对5 株霉菌产生的抑菌圈直径，挑选具有广谱抗霉能力的芽胞杆菌属（Bacillus）菌株。

1.2.2.4 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的鉴定

使用细菌基因组DNA抽提试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）提取菌株的基因组DNA，并以提 取 的DNA 为 模 板，利 用 引 物7F（5＇-CAGAG TTTGATCCTGGCT- 3＇）和1540R（5＇- AGGAGGTG ATCCAGCCGCA-3＇）进行PCR扩增。PCR反应体系、反应程序与1.2.1.2节相同。

PCR产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，使用NCBI BLAST 在线工具将测序结果与NCBI 数据库中已有细菌的16S 序列进行同源性比对。使用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.3 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物对雪茄烟叶的防霉效果

称取4 份1.2.1.3 节中抗霉菌侵染能力弱的烟叶各5 g 分别置于4 个250 mL 锥形瓶中，对烟叶喷洒3.5 mL 1.2.1.4 节中致霉性强的霉菌孢子悬浮液（孢子浓度2×104CFU/mL），静置2 h 后，分别对各烟叶进行处理（处理2-1：喷洒3.5 mL无菌水；处理2-2：喷洒3.5 mL浓度为107CFU/mL的拮抗菌菌悬液；处理2-3：喷洒3.5 mL 浓度为108CFU/mL 的拮抗菌菌悬液；处理2-4：喷洒3.5 mL浓度为109CFU/mL的拮抗菌菌悬液）。上述操作重复3次，28 ℃恒温培养箱放置4 d。烟叶表面无霉菌菌丝覆盖且烟叶无霉臭味则该浓度下拮抗菌菌悬液防霉效果强，烟叶表面有霉菌菌丝覆盖且烟叶有霉臭味则该浓度下拮抗菌菌悬液防霉效果弱。

2 结果与分析

2.1 雪茄烟叶中致霉菌的分离、纯化与鉴定

2.1.1 雪茄烟叶中霉菌的分离、纯化与鉴定

5 株霉菌在PDA 培养基上生长3 d 的菌落形态和镜检结果如图1所示。菌株ZT-1在PDA培养基上生长速度中等，菌落表面由内向外依次为褐色、青色和白色，孢子呈圆形。菌株ZT-2在PDA培养基上生长速度较慢，菌落边缘呈白色，内部呈蓝绿色，菌落有放射状沟纹，分生孢子梗多次分枝，形如扫帚。菌株ZT-3在PDA培养基上生长速度中等，菌落呈灰绿色，分生孢子梗多次分枝，形如扫帚。菌株ZT-4 在PDA培养基上生长速度较快，菌落边缘呈白色，内部呈灰绿色，孢子近球形。菌株ZT-5在PDA培养基上生长速度快，菌落整体呈黑色，边缘呈浅黄色，分生孢子梗顶端膨大。

图1 菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4和ZT-5的菌落和镜检图Fig.1 Colonies and microscopic images of strains ZT-1, ZT-2, ZT-3, ZT-4 and ZT-5

使用NCBI BLAST 在线工具进行同源性分析，发现菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4 和ZT-5 的ITS 序列分 别 与 聚 多 曲 霉（Aspergillus sydowii）（NR_131259.1）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）（NR_077145.1）、绳 状 篮 状 菌（Talaromyces funiculosus）（NR_103678.2）、云南木霉（Trichoderma yunnanense）（NR_134419.1）和 黑 曲 霉（Aspergillus niger）（NR_111348.1）的ITS 序列相似度均为100%。系统发育进化树（图2）进一步证明了菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4和ZT-5分别为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）、云 南 木霉（Trichoderma yunnanense）和黑曲霉（Aspergillus niger）。

图2 菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4和ZT-5的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic evolutionary tree of strains ZT-1, ZT-2, ZT-3, ZT-4 and ZT-5

2.1.2 不同雪茄烟叶抗霉菌侵染能力

接种混合霉菌孢子悬浮液4 d 后的雪茄烟叶见图3。湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶表面有霉菌菌丝覆盖，且烟叶有严重霉臭味，而湖北省宜昌市发酵后茄芯烟叶、湖北省宜昌市发酵后茄衣烟叶和湖北省十堰市发酵前茄衣烟叶表面无霉菌菌丝覆盖，且烟叶无霉臭味。由此可见，湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶抗混合霉菌孢子悬浮液侵染能力弱，因此选取湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶为重点防霉对象。

图3 接种混合霉菌孢子悬浮液4 d后的雪茄烟叶Fig.3 Cigar tobacco inoculated with mixed mold spore suspensions for 4 days

2.1.3 雪茄烟叶中霉菌的致霉性

不同霉菌孢子悬浮液处理4 d 后的雪茄烟叶见图4。处理1-2和处理1-3中的烟叶表面有霉菌菌丝覆盖，且烟叶有严重的霉臭味。而处理1-1、处理1-4、处理1-5 和处理1-6 中的烟叶表面无霉菌菌丝覆盖，且烟叶无霉臭味。可见，处理1-2和处理1-3中的霉菌均有强致霉性。其中，处理1-2中的烟叶表面菌丝较处理1-3更明显，故选取处理1-2中的霉菌［绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）］作为后续试验中侵染雪茄烟叶的霉菌，处理1-3 中的霉菌［黑曲霉（Aspergillus niger）］作为初步筛选拮抗菌株的指示菌。

图4 不同霉菌孢子悬浮液处理后的雪茄烟叶Fig.4 Gigar tobacco treated with different mold spore suspensions

2.2 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的筛选与鉴定

2.2.1 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的初步筛选与抑菌谱分析

通过牛津杯抑菌法筛选出6 株芽胞杆菌属（Bacillus）微生物。由图5 和表1 可见，6 株芽胞杆菌属（Bacillus）微生物对黑曲霉（Aspergillus niger）的拮抗能力较强，且具有广谱抗霉能力。其中菌株DY-9对5种霉菌的拮抗能力均最强。

表1 6株拮抗菌株的抑菌谱①Tab.1 Antifungal spectrum of 6 antagonistic strains

图5 6株拮抗菌株对不同霉菌的拮抗效果Fig.5 Antagonistic effects of 6 antagonistic strains against different molds

2.2.2 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物的鉴定

使用NCBI BLAST 在线工具进行同源性分析，发现菌株DY-1、DY-4、DY-5 和DY-7 的16S rDNA 基因序列分别与贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）（MT114570.1）、贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）（KY962336.1）、贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）（CP053764.1）和贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）（KY962336.1）的16S rDNA 基因序列相似性达99.73%、98.25%、99.53%和99.79%。DY-9 和DY-10的16S rDNA 基因序列与解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）（KY085968.1）的16S rDNA 基 因序列相似性分别为99.93%和99.80%。系统发育进化树（图6）进一步证明了菌株DY-1、DY-4、DY-5 和DY-7 为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis），菌株DY- 9 和DY- 10 为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图6 菌株DY-1、DY-4、DY-5、DY-7、DY-9和DY-10的系统发育进化树Fig.6 Phylogenetic evolutionary tree of strains DY-1, DY-4, DY-5, DY-7, DY-9 and DY-10

2.3 拮抗芽胞杆菌属（Bacillus）微生物对雪茄烟叶的防霉效果

不同浓度解淀粉芽胞杆菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciensDY-9）菌悬液处理4 d 后的雪茄烟叶见图7。处理2-1、处理2-2 和处理2-3 中的烟叶表面均有霉菌菌丝覆盖，且烟叶有严重的霉臭味。而处理2-4中的烟叶表面无霉菌菌丝覆盖，且烟叶无霉臭味，说明处理2-4 中浓度为109CFU/mL 的拮抗菌菌悬液防霉效果最佳。

图7 不同浓度解淀粉芽胞杆菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciens DY-9）菌悬液对雪茄烟叶的防霉效果Fig.7 Anti-mildew effects of different concentrations of Bacillus amyloliquefaciens DY-9 suspensions at different concentrations on cigar tobacco

3 讨论

从湖北省十堰市和宜昌市霉变雪茄烟叶样品中共分离、纯化得到5种霉菌，经形态学和分子生物学鉴定为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）、云南木霉（Trichoderma yunnanense）和黑曲霉（Aspergillus niger），这与冯克宽等［23］研究发现兰州仓储水烟中检出率最高的霉菌为黑曲霉（Aspergillus niger） 和 产 黄 青 霉（Penicillium chrysogenum）的结果相似，也与朱桂宁等［24］报道的广西地区烟仓储存烟叶中占比较高的霉菌种类较为一致，部分不一致的结果如溜曲霉（Aspergillus tamarii）在本研究中不是占比较高的霉菌，可能是地区和烟叶品种的差异所致。用分离、纯化得到的5种霉菌对烟叶进行回接侵染，发现绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）和黑曲霉（Aspergillus niger）对湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶具有强致霉性，这与赵文姬［18］对云南部分地区霉变烟叶样品进行的研究结果一致。湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶比发酵后茄芯、发酵后茄衣烟叶以及十堰市发酵前茄衣烟叶在相同处理条件下更易被霉菌侵染，这与孔凡玉等［11］研究中品种、产地及部位等会影响烟叶发生霉变的速度，且发酵前烟叶更易霉变的结论相一致。

本研究中解淀粉芽胞杆菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciensDY-9）对5 种霉菌均具有最强的拮抗能力，这与报道的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有广谱抗霉能力一致［25-27］。解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）抗霉能力强的原因可能是该菌能产生脂肽类抗生素、抑菌蛋白等多种物质［28-29］，但关于拮抗菌株的防霉作用机理和防霉代谢产物等问题仍有待进一步研究。

4 结论

从湖北省十堰市和宜昌市霉变雪茄烟叶中共分离、纯化得到5 株霉菌，经鉴定分别为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、产 黄 青 霉（Penicillium chrysogenum）、绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）、云 南 木 霉（Trichoderma yunnanense）和 黑 曲 霉（Aspergillus niger），用5株霉菌对烟叶进行回接侵染，结果表明湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶更易发生霉变，且绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）与黑曲霉（Aspergillus niger）对该烟叶有强致霉性。采用牛津杯抑菌法筛选出6株芽胞杆菌属（Bacillus）微生物，对黑曲霉（Aspergillus niger）有较强拮抗能力，还具有广谱抗霉能力，其中解淀粉芽胞杆菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciensDY-9）对分离、纯化得到的各霉菌均有最强的拮抗能力。浓度为109CFU/mL时菌株DY-9菌悬液对雪茄烟叶的防霉效果最佳。